人細(xì)胞色素P450 1A2、2C9、2E1和3A4基因克隆及表達(dá).pdf

1、本課題旨在通過(guò)基因克隆和異源表達(dá)的方法，獲得由特定基因所表達(dá)的重組細(xì)胞色素P450藥物代謝酶，為以后的酶活性鑒定和酶代謝功能研究奠定基礎(chǔ)。 1.目的基因的克隆與重組病毒的構(gòu)建分別以國(guó)外獲贈(zèng)的含有CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，同時(shí)以人肝細(xì)胞cDNA為模板PCR擴(kuò)增CYP2C9基因。對(duì)于CYP1A2和CYP2E1，分別在5’端添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，3’端添加KpnⅠ酶切位點(diǎn)，對(duì)于

2、CYP2C9和CYP3A4，分別在5’端添加SalⅠ酶切位點(diǎn)，3’端添加KpnⅠ酶切位點(diǎn)。將目的基因克隆至pCMV-Myc載體上并進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果證實(shí)已獲得完整正確的目的基因。將經(jīng)過(guò)雙酶切的目的基因片段插入經(jīng)同樣雙酶切后的pFastBacl轉(zhuǎn)座載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座后產(chǎn)生重組粘粒DNA(Bacmid)。將該重組粘粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，即產(chǎn)生重組桿狀病毒。 2.重組蛋白表達(dá)將重組桿狀病毒

3、以0.01-0.1的MOI值感染生長(zhǎng)良好的Sf9細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增重組病毒，使病毒滴度達(dá)到108pfu/mL，或更高，然后將重組病毒以MOI值5感染Sf9細(xì)胞，表達(dá)目的蛋白。收集表達(dá)72h后的Sf9細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎及離心后得到含重蛋白的溶解液。測(cè)定蛋白濃度。 3.重組蛋白表達(dá)分析Western Blot結(jié)果顯示CYP1A2、CYP2C9重組蛋白分別能與羊抗人CYP1A2、CYP2C9多克隆抗體特異性結(jié)合，這表明CYP1A2、CYP2C

4、9基因正確插入表達(dá)載體中得到正確表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果可見(jiàn)CYP1A2、CYP2C9蛋白重組CYP2E1蛋白和重組CYP3A4蛋白表達(dá)條帶，表明CYP2E1、CYP3A4基因得到正確表達(dá)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))分別表達(dá)了人CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4重組酶，其中CYP1A2和CYP2C9經(jīng)過(guò)Western Blot鑒定，結(jié)果正確