野桑蠶細胞色素P450基因的研究.pdf

1、細胞色素P450單加氧酶系是一種廣泛分布于各種需氧生物體內(nèi)的氧化酶系，由多種成分組成。很多證據(jù)表明，昆蟲細胞色素P450酶系介導的代謝抗性是大多數(shù)昆蟲產(chǎn)生抗性和對寄主植物適應性的主要機制。　　以氟化物誘導的野桑蠶中腸組織為基礎材料，根據(jù)家蠶CYP305B1基因序列設計特異性引物，通過RT-PCR分兩段擴增了野桑蠶的CYP305B1V1cDNA基因；通過拼接獲得了完整CYP305B1V1基因。測序結果顯示，野桑蠶CYP305B1V1基因

2、的ORF為1464nt，編碼487aa，具有細胞色素P450蛋白的共同特征。同源性分析表明，在DNA水平上，野桑蠶CYP305B1V1基因與家蠶CYP305B1基因的同源性達99.18％，而推導的氨基酸序列則完全一致。通過NCBI中家蠶基因組數(shù)據(jù)庫查詢、比對和拼接，預測野桑蠶CYP305B1V1基因結構中至少含有7個內(nèi)含子，且內(nèi)含子-外顯子之間的連接符合GT-AT法則?！　YP305B1V1的cDNA序列克隆進原核pET28a(+

3、)，構建了原核表達質(zhì)粒，再轉化到大腸桿菌BL21細胞中，通過IPTG誘導表達。SDS-PAGE、Westeronblotting分析表明，帶有His6標簽的重組CYP305B1V1蛋白的分子量為57kDa左右，與理論值相符。為通過純化蛋白，進一步構建細胞色素P450的體外代謝體系奠定了基礎?！　〕樘岵煌瑮l件下野桑蠶的各組織總RNA，利用DIG標記的隨機引物制備了野桑蠶CYP305B1V1cDNA探針，通過點雜交的辦法嘗試進行了CYP3