黃粉甲抗凍蛋白AFP84a定點(diǎn)突變的研究.pdf

1、昆蟲抗凍蛋白具有較高的抗凍活性，生物體內(nèi)微量的抗凍蛋白尤其是高活性的抗凍蛋白很難滿足諸多方面應(yīng)用。因此，探索出生產(chǎn)高活性抗凍蛋白的有效方法亟待解決。本研究基于此目的利用基因工程的技術(shù)和方法開展了抗凍蛋白基因的分子克隆、突變和表達(dá)工作。通過在引物上設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)A和B，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增和克隆出了融合克隆載體pUCm-T-afp84a的突變體pLICm-T-afp84a-A和pUCm-T-afp84a-B。兩個(gè)突變體與載體pMAL-c2X雙

2、酶切后連接，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-afp84a-A和pMAL-c2X-afp84a-B。2個(gè)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Ecoli TBI。經(jīng)IPTG及最適條件誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白表現(xiàn)為可溶性。超聲波細(xì)胞破碎法使2種融合蛋白分別從含有融合表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中釋放。融合蛋白運(yùn)用親和層析和分子篩層析純化后，SDS-PAGE顯示目的蛋白呈單一條帶；生物活性實(shí)驗(yàn)檢測各自目的蛋白具有一定的抗凍活性。對(duì)比結(jié)果，突變后的抗凍蛋白都具有比突變前較高的抗凍活性