小球藻外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立及其表達(dá)植酸酶的研究.pdf

1、該論文首先測定了海水小球藻對10種抗生素的敏感性，確定了小球藻基因工程適用的抗生素篩選標(biāo)記。并以抗生素為除菌工具，獲得了無菌的小球藻藻株，優(yōu)化了無菌小球藻的培養(yǎng)條件。然后以無菌的海水小球藻完整細(xì)胞為受體，以gus基因作為報告基因，優(yōu)化了電擊轉(zhuǎn)化條件。在此基礎(chǔ)上，將植酸酶基因轉(zhuǎn)入小球藻中，獲得了轉(zhuǎn)基因藻株。這不僅為低成本生產(chǎn)植酸酶，使其得以廣泛應(yīng)用，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益打下了基礎(chǔ)，同時也為藻類生物反應(yīng)器的建立及廣泛應(yīng)用開辟了道路。

2、 研究內(nèi)容及結(jié)果： 1、研究了海水小球藻對10種常見抗生素的敏感性及淡化培養(yǎng)對小球藻生長的影響，并測定了潮霉素、G418、氯霉素、Zeocin對小球藻在海水培養(yǎng)基和淡化十倍培養(yǎng)基中的半致死劑量。實驗結(jié)果表明，小球藻對卡那霉素、慶大霉素、新霉素、氨芐青霉素、頭孢霉素、鏈霉素都不敏感，這幾種抗生素在實驗范圍內(nèi)不對小球藻的生長產(chǎn)生明顯抑制；小球藻對潮霉素較敏感，對G418則很敏感，對氯霉素、Zeocin極敏感。淡化十倍培養(yǎng)對小

3、球藻的生長沒有顯著影響，且能使小球藻對抗生素的敏感性大為提高。G418適合作為小球藻基因工程的選擇試劑，其在固體培養(yǎng)基中的適宜篩選濃度為140.5μg/mL。 2、研究了以抗生素為除菌工具，建立小球藻無菌培養(yǎng)體系的途徑。首先測定了小球藻培養(yǎng)液中的細(xì)菌對小球藻不敏感的6種抗生素的敏感性，然后研究了適于小球藻除菌的抗生素組合和處理濃度及加入抗生素對小球藻和細(xì)菌生長的影響。結(jié)果表明小球藻培養(yǎng)體系中的細(xì)菌對慶大霉素、氨芐青霉素、卡那霉素

4、、頭孢霉素和鏈霉素非常敏感，利用涂平板挑單克隆法去除霉菌后，將這五種抗生素均以終濃度100μg/mL加入小球藻培養(yǎng)體系中，處理兩次，獲得了無菌的小球藻藻株。進(jìn)一步研究了接種密度、光強(qiáng)、pH和溫度對小球藻生長的影響，并在無菌培養(yǎng)條件下，對影響無菌小球藻生長的五種主要營養(yǎng)因素：NaHCO3、KNO3、KH2PO4、VB1、VB12進(jìn)行了優(yōu)化。得到小球藻適宜的培養(yǎng)條件為：初始接種濃度取藻體細(xì)胞數(shù)為4.27×106個/mL左右；pH范圍在10左

5、右；培養(yǎng)溫度為25±0.5℃；光照強(qiáng)度約為3.0×103～1.0×1041x。通過五因素四水平正交實驗，得到適于無菌小球藻生長的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：KNO30.5g/L、NaHCO30.2g/L、VB121.0μg/L、KH2PO40.02g/L、VB10.3mg/L。該優(yōu)化配方加上f/2微量元素后具有明顯的生長優(yōu)勢。 3、以無菌的海水小球藻完整細(xì)胞為受體，利用CaMV35S啟動子作為5'上游調(diào)控元件，以gus基因作為報告基因，利

6、用電擊法將gus基因轉(zhuǎn)入小球藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬間表達(dá)，研究了電擊轉(zhuǎn)化條件、滲透處理、外源DNA濃度、運(yùn)載DNA濃度和小球藻細(xì)胞生長時期對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，在5kV的脈沖電壓、0.05s的脈沖持續(xù)時間、90個脈沖循環(huán)和211的脈沖次數(shù)下電擊可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率；滲透處理能顯著提高轉(zhuǎn)化效率；運(yùn)載DNA的濃度為150μg/mL、質(zhì)粒DNA濃度為6μg/mL時轉(zhuǎn)化效率最高；而且處于對數(shù)生長早期的小球藻細(xì)胞對外源基因有更強(qiáng)的吸納能力，能獲得較

7、高的轉(zhuǎn)化效率。 4、在優(yōu)化的電擊條件下，用構(gòu)建的含有來源于無花果曲霉A.ficuumAS3.324的植酸酶基因的表達(dá)載體pBI121/phyAⅡ與無菌的海水小球藻完整細(xì)胞共轉(zhuǎn)化，經(jīng)G418抗性平板篩選、PCR檢測、Southern雜交檢測、RT-PCR檢測、植酸酶活性檢測，確認(rèn)獲得轉(zhuǎn)植酸酶基因的小球藻藻株，且phyAⅡ基因在小球藻細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并得到表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小球藻的植酸酶性質(zhì)與無花果曲霉A.ficuumAS3.324的植酸酶