Dkk調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ).pdf

1、Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞極化產(chǎn)生和細(xì)胞命運(yùn)分化等過程中發(fā)揮重要作用。Wnt信號(hào)異常也與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病密切相關(guān)。規(guī)范型Wnt通路的活化需要Wnt蛋白與受體Fz蛋白和共受體LRP5/6同時(shí)結(jié)合。Dkk蛋白是規(guī)范型Wnt信號(hào)通路的拮抗劑,對(duì)于胚胎細(xì)胞命運(yùn)和骨的形成非常關(guān)鍵。Dkk蛋白含有兩個(gè)特征性的富含半胱氨酸的亞基,分別稱為N端半胱氨酸富含亞基和C端半胱氨酸富含亞基。Dkk通過C端半胱氨酸富含亞基與LRP5/6胞外β螺旋槳結(jié)構(gòu)

2、域相互作用從而抑制規(guī)范型Wnt信號(hào)通路；Dkk N端半胱氨酸富含亞基不與LRP5/6結(jié)合,對(duì)C端亞基起調(diào)節(jié)作用。然而,Dkk與LRP5/6相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)還不清楚。在此研究論文中,我們利用核磁共振譜學(xué)方法解析了小鼠Dkk2的N端和C端半胱氨酸富含亞基(分別稱為Dkk2C和Dkk2N)的三維結(jié)構(gòu),并研究了Dkk2C與LRP5/6胞外β螺旋槳結(jié)構(gòu)域相互作用的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。 首先,為了有效的制備重組Dkk2C和Dkk2N蛋白,

3、我們構(gòu)建了硫氧還蛋白(Trx)-Dkk2C/Dkk2N融合表達(dá)載體,使其在Origami B菌株中高效表達(dá)。我們利用鎳柱親和層析和HPLC方法純化Dkk2C和Dkk2N蛋白,得到了折疊并具有正確生物活性的蛋白。由此,我們建立了一種從大腸桿菌中有效表達(dá)并純化富含雙硫鍵的蛋白的方法。 我們利用高分辨率核磁共振譜學(xué)方法,解析了Dkk2C的溶液三維結(jié)構(gòu)。Dkk2C屬于富含二硫鍵的扁平的小蛋白分子,具有對(duì)稱的折疊模式。Dkk2C結(jié)構(gòu)含有

4、兩個(gè)由反平行β折疊組成的β片層核心區(qū)域,不同長(zhǎng)度的柔性區(qū)域?qū)⑦@些β折疊連接起來,分子內(nèi)的五個(gè)雙硫鍵將整個(gè)分子緊密的折疊在一起,導(dǎo)致了分子的高度穩(wěn)定性。 以前的定點(diǎn)突變研究確定了Dkk和LRP5/6相互作用的可能的結(jié)合位點(diǎn),以此為指導(dǎo),我們利用軟件HADDOCK的蛋白一蛋白對(duì)接模擬計(jì)算的方法構(gòu)建了Dkk2C與LRP5/6胞外三個(gè)β螺旋槳結(jié)構(gòu)域(分別稱為L(zhǎng)RP5-PD1、LRP5-PD2和LRP5-PD3)相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu),建

5、立了Dkk與LRP5/6相互作用的模型。結(jié)果顯示,在酸性pH條件下,Dkk2C選擇性與LRP5-PD3結(jié)合,并具有最大親和力；另外,Dkk2C中的殘基H198及其質(zhì)子化狀態(tài)對(duì)于Dkk2C和LRP5-PD3的結(jié)合十分關(guān)鍵,提示pH在調(diào)節(jié)Dkk2C結(jié)合LRP5/6胞外β螺旋槳結(jié)構(gòu)域從而抑制Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。最后,我們利用核磁共振譜學(xué)方法解析了Dkk2N的溶液三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Dkk2N與Dkk2C的結(jié)構(gòu)具有明顯的相似性。對(duì)全長(zhǎng)Dkk

6、2的研究表明,Dkk2C與Dkk2N在全長(zhǎng)Dkk2分子中是相互獨(dú)立的,彼此間不存在相互作用。 這些研究結(jié)果不僅增加了我們對(duì)Dkk調(diào)節(jié)規(guī)范型Wnt信號(hào)通路的理解而且擴(kuò)展了尋找新型治療靶點(diǎn)的范圍,對(duì)于基礎(chǔ)科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)治療都具有重要意義。 此外,我們還研究了蘆薈大黃素對(duì)正常和細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(pMtp)釋放TNF-α和[Ca2+]i動(dòng)力學(xué)的影響。其效應(yīng)表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用,低濃度時(shí)對(duì)[Ca2+]i