Wnt-β-Catenin信號通路對正常和腫瘤性肝前體細胞活化的調(diào)節(jié).pdf

1、本研究分為二部分： 一、經(jīng)典Wnt信號通路在大、小鼠肝前體細胞活化中的調(diào)節(jié)作用 研究背景和目的： 肝臟是是人體最大的外分泌器官,具有極強的再生功能。在正常生理狀態(tài)下或輕度肝損傷時,肝細胞參與增殖和分化,維持肝臟的正常功能。當出現(xiàn)廣泛和慢性的肝損傷導致肝細胞大量破壞和丟失而且肝細胞的增殖能力被抑制時,肝臟通過前體細胞的增殖和分化來完成肝臟再生。肝前體細胞同時表達肝系標志物和膽系標志物,并且能夠向肝細胞或膽管上皮細胞

2、分化。肝前體細胞被發(fā)現(xiàn)參與一系列肝臟損傷性疾病,并且在肝纖維化和肝臟腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。 β-Catenin既是細胞連接的重要組成部分,又是經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵信號分子。Wnt/β-catenin信號通路在眾多組織中是調(diào)控細胞增殖、分化和遷移的重要通路,在肝臟的各種生物學功能中同樣發(fā)揮著重要作用。β-Catenin對于胚胎肝臟發(fā)育和肝切除術(shù)后的肝臟再生至關(guān)重要。在多種肝臟腫瘤,尤其是肝細胞癌中,普遍存在β-catenin

3、在細胞漿的聚集和/或核轉(zhuǎn)位。但是,Wnt/β-catenin信號通路在肝前體細胞活化中的重要作用依然尚未明確。 本研究擬首先通過建立大、小鼠肝前體絀胞活化動物模型,觀察在前體細胞活化過程中Wnt/β-catenin信號通路活性的變化情況；繼而結(jié)合體內(nèi)實驗,觀察經(jīng)典Wnt信號通路的激活對肝前體細胞的活化或其參與肝臟再生能力的影響,從而從體內(nèi)、體外兩個水平證實Wnt/β-catenin信號通路對前體細胞的活化具有調(diào)節(jié)作用。

4、實驗方法： 1、建立大鼠肝前體細胞活化模型； 2、用免疫組織化學和Western Blot等方法研究在大鼠肝前體細胞活化過程中Wnt/β-catenin信號通路活性的變化情況； 3、通過體外培養(yǎng)的肝前體細胞樣細胞系研究Wnt/β-catenin信號通路的過度激活對細胞增殖特性的影響； 4、運用細胞移植的實驗研究Wnt/β-catenin信號通路的過度激活對前體細胞參與肝再生能力的影響； 5、建立小

5、鼠肝前體細胞活化模型； 6、通過免疫組織化學和染色質(zhì)免疫共沉淀的方法研究在小鼠肝前體細胞活化過程中Wnt/β-catenin信號通路活性的變化情況； 7、通過質(zhì)粒注射的方法從體內(nèi)水平研究Wnt/β-catenin信號通路的過度激活對前體細胞活化的影響。 結(jié)果： 1、在大鼠肝前體細胞活化過程中,伴隨Wnt/β-catenin信號通路活性的升高； 2、大鼠肝前體細胞具有更高的Wnt/β-catenin

6、信號通路活性； 3、Wnt/β-catenin信號通路的激活不僅能在體外促進肝前體細胞樣細胞系的增殖,而且能促進其參與肝臟再生的能力； 4、在小鼠肝前體細胞活化過程中,伴隨Wnt/β-catenin信號通路活性的升高,并且小鼠肝前體細胞同樣具有更高的Wnt/β-catenin信號通路活性； 5、通過質(zhì)粒注射的方法提高Wnt/β-catenin信號通路活性能促進肝前體細胞的活化。 結(jié)論： 本研究在大

7、鼠和小鼠兩種肝前體細胞活化模型中研究了Wnt/β-catenin信號通路的重要作用,不僅發(fā)現(xiàn)了在肝前體細胞活化中伴隨著Wnt/β-catenin信號通路活性的顯著升高,而且發(fā)現(xiàn)肝前體細胞具有較高的Wnt/β-catenin信號通路活性。更重要的是發(fā)現(xiàn)提高前體細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性,能夠促進前體細胞的活化及其參與肝再生的能力。 二、Wnt/β-Catenin信號通路對OV6+肝癌前體細胞的調(diào)節(jié)作用

8、背景和目的: 干細胞代表著具有自我更新能力、能分化為子代細胞來修復組織的一個數(shù)量非常少的細胞亞群。在許多實體腫瘤的發(fā)生和進展中存在干/前體細胞起源和腫瘤細胞等級模型,具備自我更新能力的干/前體細胞可能是眾多腫瘤的起源。隨著肝干細胞生物學的進展,人們認為在肝細胞癌中也存在著腫瘤干/前體細胞,并且他們與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。 Wnt/β-catenin信號通路在眾多組織中是調(diào)控細胞增殖、分化和遷移的重要通路,與造血干細胞、神經(jīng)

9、干細胞和上皮干細胞等眾多組織來源的干細胞的功能維持密切相關(guān)。在肝臟,Wnt/β-catenin信號通路與肝臟發(fā)育中的細胞增殖、肝再生和腫瘤生長也存在緊密聯(lián)系,但其在肝干/前體細胞中的功能仍知之甚少。 本研究將從人肝細胞癌標本和體外培養(yǎng)的肝癌細胞系入手,結(jié)合肝前體細胞標志物OV6,一方面鑒定、分選出這樣一個具有前體細胞特性的細胞亞群,并研究其細胞特性；另一方而,詳細闡述Wnt/β-catenin信號通路對這部分前體細胞功能的調(diào)節(jié),

10、尤其是對其自我更新能力和其它干/前體細胞特性的調(diào)節(jié)作用。 實驗方法： 1、用免疫組織化學的方法檢測OV6+肝前體細胞在正常肝臟、肝硬化、肝細胞癌中的分布情況； 2、用流式細胞儀檢測在體外培養(yǎng)的肝癌細胞系中OV6+肝癌細胞的比例； 3、使用MACS的方法從肝癌細胞系中分選出這部分OV6+肝癌細胞,并用RT-PCR的方法分析這部分OV6+肝癌細胞的特性； 4、觀察這部分OV6+肝癌細胞成瘤性；

11、 5、流式細胞儀檢測Wnt/β-catenin信號通路的激活(BIO刺激)對OV6+肝癌細胞自我更新能力的影響； 6、構(gòu)建干擾β-catenin慢病毒所需質(zhì)粒,包裝、純化慢病毒； 7、流式細胞儀檢測通過干擾β-catenin慢病毒降低Wnt/β-catenin信號通路活性對OV6+肝癌細胞自我更新能力的影響； 8、檢測OV6+肝癌細胞對常規(guī)化療藥物的耐受性(克隆形成實驗); 9、觀察通過干擾β-caten

12、in慢病毒降低Wnt/β-catenin信號通路活性對OV6+肝癌細胞藥物耐受性的影響。 結(jié)果： 1、在正常肝臟、肝硬化、肝細胞癌標本中均發(fā)現(xiàn)OV6+肝前體細胞的存在； 2、在體外培養(yǎng)的肝癌細胞系中也存在OV6+肝癌細胞,其比例為0.2％到3％； 3、OV6+肝癌細胞具有干/前體細胞特性,在NOD/SCID小鼠體內(nèi)具有更高的成瘤性； 4、Wnt/β-catenin信號通路的激活能顯著提高這部分OV

13、6+肝癌細胞的比例,并促進其自我更新；干擾β-catenin的慢病毒能降低Wnt/β-catenin信號通路活性并降低了其自我更新的能力； 5、OV6+肝癌細胞對常規(guī)化療藥物具有更高的耐受性； 6、干擾β-catenin的慢病毒能降低Wnt/β-catenin信號通路活性并提高這部分OV6+肝癌細胞對藥物的敏感性； 結(jié)論： 本研究從人肝細胞癌標本和體外培養(yǎng)的肝癌細胞系兩個方面,結(jié)合肝前體細胞標志物OV6,