抗小麥黃矮病候選基因的克隆、特性分析及病原誘導啟動子的分離.pdf

1、小麥黃矮病(wheat yellow dwarf disease，WYD)是小麥的主要病害之一，由蚜蟲傳播的大麥黃矮病毒(BYDV)引起，常造成巨大損失。小麥的近緣種-中間偃麥草對大麥黃矮病毒具有高度抗性，它至少包含三個抗黃矮病基因，分別定位于7St、7E和2Ai-2染色體上。其中有一個基因被精確定位在中間偃麥草7X(St)染色體長臂端部，被命名為Bdv2。通過遠緣雜交與生物技術已將中間偃麥草的黃矮病抗性基因(Bdv2)導入普通小麥基因

2、組，選育出抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系HW642等。但是該抗性基因介導的抗黃矮病反應分子機制尚待研究。研究表明，植物抗病基因編碼的蛋白質決定著寄主植物能否打開抗病系統(tǒng)或打開該系統(tǒng)的程度，真正起抗病作用的是誘導表達的防御基因的產(chǎn)物。因此在抗病植株中篩選和分離BYDV誘導表達的基因，并分析它們的功能，可為揭示小麥抗黃矮病分子機制和抗病基因工程高效育種開辟新途徑，保證小麥的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)具有非常重要的意義。 本研究利用cDNA-AFLP

3、技術篩選出BYDV誘導的特異表達片段，設計特異引物，利用3RACE技術、篩選BYDV誘導的cDNA文庫和5RACE技術，克隆了兩個抗小麥黃矮病的候選基因P38M16和P6M3的cDNA全長序列。候選基因P38M16cDNA全長序列為3218bp,其中ORF為1938bp，編碼646個氨基酸。候選基因P6M3在抗病小麥HW642和中間偃麥草Ti中均擴增出包含全長ORF序列，分別暫命名為TaP6M3與TiP6M3。TaP6M3 cDNA全長

4、序列為4106bp，其中ORF為3180bp，編碼1060個氨基酸；TiP6M3長4072bp，其中ORF為3096bp，編碼1032個氨基酸。TaP6M3與TiP6M3的eDNA序列一致性為92.19％，氨基酸一致性為88.89％。通過在NCBI(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/blast)中的blastP分別對兩候選基因全長cDNA序列編碼的氨基酸序列進行了保守結構域的搜索，結果表明，兩基因編碼的產(chǎn)物均具有N

5、BS、LRR等一系列抗病基因的保守結構域，表明兩基因編碼的蛋白為NBS-LRR抗病類似蛋白。 利用半定量RT-PCR的方法對克隆的兩個候選基因進行表達分析表明，兩候選基因均屬組成型表達，不受BYDV、SA和JA誘導。對P38M16基因在小麥抗感材料和中間偃麥草基因組中分布情況分析，結果表明在中間偃麥草和抗病易位系HW642中均有6個拷貝，而在感病小麥中8601中只有5個拷貝。 構建了病毒誘導基因沉默(VIGS)載體，為在

6、小麥上建立病毒誘導的基因沉默體系作準備，為快速分析小麥及其近緣種新基因的功能提供新的有力工具。 植物基因的表達調(diào)控已成為分子生物學研究熱點，啟動子是基因表達調(diào)控的重要順式元件，啟動子的克隆對研究基因表達調(diào)控、構建基因工程載體、表達目的蛋白有著重要的意義。GLU，ERFlb為病原誘導的小麥基因。為克隆小麥GLU，ERFlb基因的啟動子，將小麥基因組DNA分別用HindⅢ酶切，酶切片段與一特殊的銜接頭連接。取連接產(chǎn)物作模板，以銜接頭

7、引物和基因特異引物進行PCR擴增。將HindⅢ．銜接頭體系的PCR產(chǎn)物克隆、測序。對抗病相關啟動子的克隆用銜接頭PCR方法進行了摸索，分離出部分啟動子序列，由于六倍體普通小麥的基因組規(guī)模較大，重復序列多，單靠一端序列向5端延伸，經(jīng)常會發(fā)生偏離。實驗室將在以后的試驗中再利用其它啟動子的克隆方法進行摸索，以獲得啟動子全長序列，并構建分離的啟動子-GUS嵌合基因表達載體及其在植物組織中的瞬時表達試驗，隨后將分離的啟動子與抗病相關基因構建到單子