沉默SURVIVIN抑制小細胞肺癌細胞增殖和逆轉化療耐藥性研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是危害人類健康的主要疾病之一，按病理類型分為非小細胞肺癌(NoneSmall Cell Lung Cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer, SCLC)。近10年來隨著對肺癌分子生物學進行深入研究，針對EGFR(Epithelial GrowthFactor Receptor，表皮生長因子受體)、ALK（Anaplasticlymphoma Kinase，間變性淋巴瘤激

2、酶）融合蛋白的分子靶向藥物的臨床廣泛應用，晚期非小細胞肺癌生存時間及生活質量取得明顯的延長和提高，為NSCLC開辟了新的治療途徑。小細胞肺癌患者占全部肺癌的15～20％，SCLC的生物學特征:腫瘤細胞倍增時間短;早期容易出現遠處轉移;一線化療敏感性高等特性。然而近30年小細胞肺癌治療療效幾乎停步不前，5年生存率不到5％。目前SCLC主要治療措施為全身化療或聯(lián)合局部放療，一線化療有效率達60-80％，而化療后極易耐藥，導致復發(fā)轉移;二線治

3、療目前缺乏有效的治療手段。目前研究發(fā)現SCLC存在大量體細胞突變及異質性，盡管關于小細胞肺癌的臨床試驗進行了很多，但是最后證明有效的卻很少，迄今尚未發(fā)現有效的分子治療靶點。SCLC一致以來就是臨床研究中的一項難題，迫切需要新的有效治療手段。較為熱門的研究主要集中在改善化療耐藥以及新的治療手段（如免疫治療、生物導彈治療等）研發(fā)。
　　細胞凋亡由多基因調控的細胞程序化死亡方式，以維持內環(huán)境穩(wěn)定;在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。凋亡

4、抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Proteins，IAPs)是一族主要凋亡抑制因子，包括8種蛋白因子。Survivin基因即是IAPs中一名重要的家庭成員，在組織細胞的分布上具有鮮明的特點，主要表現為細胞分布上的選擇性，即除了胸腺和生殖腺組織細胞外在成年人其他分化組織細胞中皆未表達，主要表達在大部分的惡性腫瘤細胞組織中。其主要功能為:促進細胞的生長增值，抑制細胞凋亡。近幾年研究發(fā)現Survivin基因與腫瘤細胞對

5、化療產生耐藥性密切相關，可能為腫瘤化療耐藥的機制之一。
　　近年來Survivin基因在肺癌方面的研究逐漸增多。NSCLC患者Survivin蛋白在腫瘤組織中高表達，與臨床分期較晚、無病生存期短及總生存時間短密切相關，可能作為一種NSCLC患者診斷敏感指標和治療靶點。但目前大部分試驗主要集中在NSCLC，對于SCLC研究目前尚處于探索期。特別針對SCLC的前期化療敏感，極易耐藥導致復發(fā)轉移的特點，探索Survivin基因在小細胞肺

6、癌的發(fā)生發(fā)展的作用及逆轉化療耐藥，提供可行性及必要性，以便能找到有效的治療手段。
　　方法：
　　1、采用免疫組化方法（SP法），檢測120例SCLC癌組織和13例癌旁正常肺標本中Survivin蛋白的表達情況，并結合患者基本臨床資料及隨訪結果進行相關分析。
　　2、利用脂質體包裹Survivin基因序列特異性siRNA，轉染人小細胞肺癌細胞株NCI-H446，實驗分為3組:Survivin SiRNA轉染組(Si-S

7、ur組)，無意SiRNA轉染組（Si-NC組）和單純脂質體轉染組（正常對照組）。采用RT-PCR、Western blot技術檢測Survivin mRNA及蛋白表達;噻唑藍(MTT)比色法檢測腫瘤細胞在增值方面的具體情況;微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell實驗）小細胞肺癌細胞遷移能力。
　　3、體外實驗利用脂質體包裹SurvivinSiRNA，轉染人小細胞肺癌耐藥細胞株NCI-H446/VP，實驗分為3組:S

8、urvivin SiRNA轉染組(Si-Sur組)，無意SiRNA轉染組（Si-NC組）和單純脂質體轉染組（正常對照組）。觀察癌細胞的生物特性的變化;采用流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡。Westernblot檢測細胞survivin蛋白、Bcl-2蛋白，Bax蛋白及Cleaved Caspase-3蛋白的含量與相關性，初步探索SURVIVIN逆轉耐藥機制。
　　結果：
　　1、Survivin蛋白在小細胞

9、肺患者中陽性表達率為62.5％(75/120)，而在正常13例肺組織中，有1例病灶旁正常肺組織的Survivin蛋白弱表達，所占比例為7.7％，兩組的差異具有明顯的統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。在混合型SCLC患者18中，有5例(27.8％)患者的Survivin蛋白弱表達，而在單純SCLC患者中，68.6％(70/102)患者的Survivin蛋白高表達，具有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。大約16.7％(2/12)小細胞肺癌局限期(

10、T1-2N0M0)期的患者中存在Survivin蛋白表達，且為弱表達。而其他局限期及廣泛期患者中Survivin蛋白表達比例分別為:58.5％(24/41)，73.1％(49/67)。表明Survivin蛋白在SCLC中隨著臨床分期的升高，其陽性率也逐漸增高，其差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。在腦轉移的SCLC中，Survivin蛋白表達的比例大約91.5％，在無腦轉移的SCLC中陽性表達率只有20.4％，二者之間的差異明顯，具有統(tǒng)

11、計學意義。在SCLC中Survivin蛋白表達情況與性別、年齡及吸煙等無明顯相關性。癌組織Survivin蛋白表達是影響小細胞肺癌患者預后的獨立危險因素，高表達組與陰性表達組的中位生存時間比值為8月∶17月，無進展生存期為4∶8月。
　　2、RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現Si-Sur轉染組相對于對照組，NCI-H446細胞Survivin基因在mRNA及蛋白水平明顯下降。觀測NCI-H446細胞經各組處理后在1周內

12、的增殖情況;MTT實驗結果提示在Si-Sur脂質體轉染組細胞增殖明顯受到抑制，而在Si-NC組與空白對照組中NCI-H446細胞的增殖速度無明顯差異，三組之間具有明顯差異，并具有統(tǒng)計學意義。同時也觀察到Si-Sur脂質體轉染NCI-H446細胞后體積、排列情況也發(fā)生明顯變化;Transwell小室結合結晶紫染色檢測細胞侵襲能力結果顯示:通過酶標儀測量OD值，結果顯示Si-Sur組細胞OD值與對照組相比明顯降低，存在顯著性差異(F156.

13、350，P＜0.05)。而陰性對照組OD值與對照組的數值相比略為下降，并沒有表現出明顯的差異（P＞0.05）。在Si-Sur組腫瘤細胞侵襲能力受到明顯抑制。
　　3、NCI-H446/VP細胞在不同依托泊苷濃度中Si-Sur組細胞與Si-NC組以及空白對照組相比，存活率較低，存在著顯著的差異變化，具有統(tǒng)計學意義，而對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。這表明SiRNASurvivin可以一定程度上逆轉NCI-H446/VP

14、細胞對依托泊苷的耐藥性。在Si-Sur轉染組中，對依托泊苷的耐藥指數是7.62，對照組中轉染Si-NC和NCI-H446/VP對依托泊苷的耐藥指數分別是11.17、11.39，三組之間具有明顯差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。為了解其逆轉耐藥作用機制，流式細胞儀分析檢測三組(SiSurvivin組、Si NC組及空白對照組)細胞凋亡水平分別為49.512±0.248;5.500±0.529;4.890±0.854。Western b

15、lot檢測實驗三組Survivn蛋白分別為0.032±0.012,0.081±0.007,0.123±0.004; Cleaved Caspase-3蛋白為1.374±0.015,0.240±0.016，0.232±0.033，Bax蛋白為0.334±0.015，0.077±0.005，0.046±0.005;Bcl-2蛋白為0.045±0.013，0.147±0.012，0.381±0.017，對三組的蛋白進行比較，可以發(fā)現三組之間的

16、數據具有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。根據檢測結果可知對比正常細胞對照組、陰性對照組，Survivin蛋白在Si-Sur組條帶灰度值減弱，表明Survivin的表達出現了鮮明的下調現象，三組之間表現出了明顯的差異，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示Si-Sur可抑制Survivin的蛋白表達。Western blot檢測各組Survivin蛋白、Cleaved Caspase3、BAX蛋白及Bcl-2蛋白的表達情況，結

17、果顯示在Si-Sur組Cleaved Caspase3蛋白及Bax蛋白顯著升高，而Bcl-2蛋白的表達顯著下降。對比空白對照組、陰性對照組在SiSurvivin組中Cleaved Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達，差異顯著具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.SCLC組織Survivin蛋白高表達，與患者臨床分期、腦轉移及化療療效密切相關，癌組織Survivin高表達的患者預后較差。
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