擬南芥Aux-IAA家族基因IAA2的反向遺傳學(xué)功能研究.pdf

1、生長素(auxin)是最早發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，在植物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮十分重要的作用，主要包括細(xì)胞伸長，細(xì)胞分裂，向地性和向光性的形成，維管組織的發(fā)育，根毛發(fā)育，花的形成等等。生長素的作用機(jī)制非常復(fù)雜的。近年來，生長素調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子機(jī)理取得了較大進(jìn)展。其中Aux/IAA蛋白，作為一類轉(zhuǎn)錄抑制因子，已經(jīng)被證明在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到極其重要的作用。 Aux/IAA基因發(fā)生突變會使生長素反應(yīng)因子(ARF)的功能產(chǎn)生紊亂，從而引起生

2、長素相關(guān)生長和發(fā)育的異常。IAA2是擬南芥29個Aux/IAA基因家族成員之一，目前對該基因研究很少，還沒有篩選到此基因的突變體。本文利用反向遺傳學(xué)方法研究IAA2在擬南芥生長和發(fā)育中的功能，得到以下主要結(jié)果： 1．利用ATP計劃(Arabidopsis Tilling Program)提供的TILLING(Target Induced Lesoins in Local Genomics)技術(shù)服務(wù)共得到關(guān)于IAA2基因的10個點

3、突變，用SIFT軟件分析發(fā)現(xiàn)其中三個位點突變可能對蛋白質(zhì)造成了毒害，但是，對這三個突變體進(jìn)行表型觀察時沒有發(fā)現(xiàn)生長和發(fā)育的異常，揭示IAA2基因的功能冗余性。 2．為了研究擬南芥生長和發(fā)育中IAA2基因的表達(dá)模式，我們構(gòu)建了新的 IAA2::uidA(GUS)報告株系。觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色模式發(fā)現(xiàn)，IAA2除了在維管組織表達(dá)外，還在生長素累積最多的地方表達(dá)，外源生長素處理能夠強(qiáng)化這種表達(dá)。IAA2表達(dá)模式不同于已經(jīng)報道的

4、IAA7，IAA14，IAA17和IAA28。 3．用35S啟動子過量表達(dá)野生型IAA2，也用雙鏈RNA技術(shù)干涉內(nèi)源IAA2，分別得到了35個和26個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。對這些株系進(jìn)行表型觀察，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的生長和發(fā)育異常。這兩個實驗進(jìn)一步提示了IAA2基因功能的冗余性。 4．利用Bgl Ⅱ酶切位點，通過了三輪PCR反應(yīng)，定點突變了IAA2蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的兩個相鄰的脯氨酸殘基iaa2<'P65S>和iaa2<'P66L>。

5、用35S啟動子過量表達(dá)這兩個定點突變的基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥菜在生長和發(fā)育上存在諸多明顯缺陷。令人感興趣的是，過量表達(dá)脯氨酸雙突變(iaa2<'P65SP66L>，轉(zhuǎn)基因植株的表型是正常的。 5．iaa2<'P65S>和iaa2<'P66L>轉(zhuǎn)基因株系展示了多效性生長素相關(guān)的表型，主要包括，主根和下胚軸延伸的抑制，根和下胚軸的向地性缺陷，主根延伸和側(cè)根誘導(dǎo)對外源生長素處理的敏感度下降，不定根數(shù)量增加，葉片上卷，頂端優(yōu)勢減弱等等，

6、這些表型在其他Aux/IAAs基因中已經(jīng)有所報道。另外，有些表型，如葉柄偏上生長、主根原基的發(fā)育異常，這些是IAA2突變后所特有的表型。這些結(jié)果說明IAA2在擬南芥生長和發(fā)育中既有冗余但又有獨特的功能。 6．用熒光顯微鏡觀察了5種融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的的熒光信號，發(fā)現(xiàn)EGFP-iaa2<'P65S>、ECFP-iaa2<'P65S>和ECFP-iaa2<'P66L>三者的熒光強(qiáng)度很強(qiáng)，均顯著高于野生型EGFP-IAA2(近2

7、0倍)，說明脯氨酸單突變增加了IAA2蛋白的穩(wěn)定性(轉(zhuǎn)錄抑制因子不易被降解了)，也同時產(chǎn)生了生長素相關(guān)的表型缺陷。 7．用Westem-blots檢測了融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的累積，發(fā)現(xiàn) ECFP-iaa2<'P65S>和。ECFP-iaa2<'P66L>大量累積，而野生型ECFP-IAA2只有微弱累積信號。在生長素處理下，ECFP-iaa2M<'P65S>和ECFP-iaa2<'P66L>很難被降解，野生型ECFP-IAA2