LF基因在鼻咽癌細(xì)胞系中遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)改變及其功能糾正的初步研究.pdf

1、本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了 LF 基因在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)、遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)改變。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)恢復(fù)鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中LF基因的表達(dá)，并觀察LF基因恢復(fù)表達(dá)后對(duì)5-8F細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，明確 LF 基因在5-8F細(xì)胞中的作用，為L(zhǎng)F基因與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性提供初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下： 第一部分鼻咽癌細(xì)胞系中LF基因表達(dá)及遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)改變。 采用RT-PCR、Real-time RT

2、-PCR方法檢測(cè)LF基因在8例慢性鼻咽炎組織和7株鼻咽癌細(xì)胞(HNE1、HNE2、HNE3、CNE1、CNE2、5-8F、6-10B)中的表達(dá)，結(jié)果顯示LF基因在慢性鼻咽炎組織中穩(wěn)定表達(dá)，在所有鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失或下調(diào)(P=0.001)。為了進(jìn)一步闡明LF基因在鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)失活的分子機(jī)制，從遺傳學(xué) (LOH、基因突變)和表遺傳學(xué)(基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化)兩方面進(jìn)行了分析。通過(guò)PCR-SSCP和測(cè)序方法分析了LF 基因啟動(dòng)子區(qū)、第1

3、外顯子和第2外顯子的突變情況。在7種鼻咽癌細(xì)胞系中，僅檢測(cè)到在HNEl細(xì)胞系存在LF基因啟動(dòng)子區(qū)突變(1076delC)，而在其他位點(diǎn)和細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)突變，即LF基因在鼻咽癌細(xì)胞系中的突變檢測(cè)率為14％(1/7)，推測(cè)該突變可能通過(guò)影響 LF 基因啟動(dòng)子與反式作用因子的結(jié)合，導(dǎo)致LF基因的表達(dá)失活。此外，結(jié)果也證實(shí)了LF基因的第二外顯子存在多態(tài)性。 采用PCR-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳．銀染方法，對(duì)7種鼻咽癌細(xì)胞系中微衛(wèi)星位點(diǎn)(D

4、3S4169、GBD：181215、D3S1478、G59627和RH119558)的雜合性缺失情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)CNE1細(xì)胞系在D3S1478位點(diǎn)存在LOH，其余細(xì)胞系及其它位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)LOH，即LF基因在鼻咽癌細(xì)胞系中的的LOH檢測(cè)率為14％(117)，提示微衛(wèi)星位點(diǎn)的雜合性丟失可能對(duì) LF 在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)起了一定的作用。 為了探討LF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與鼻咽癌細(xì)胞系中LF基因的表達(dá)缺失或下調(diào)之間是否存在關(guān)系，

5、采用了甲基化特異性PCR方法檢測(cè)了7種鼻咽癌細(xì)胞系中 LF 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況。結(jié)果顯示所有鼻咽癌細(xì)胞系中LF基因啟動(dòng)子區(qū)均存在甲基化，其中CNE2和5-8F細(xì)胞中 LF 基因啟動(dòng)子區(qū)存在不完全甲基化。這些結(jié)果說(shuō)明啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是鼻咽癌細(xì)胞系中 LF 基因表達(dá)失活的主要原因。 第二部分鼻咽癌候選抑瘤基因 LF 功能的初步研究。 采用RT-PCR方法從慢性鼻咽炎組織中克隆 LF 基因的開(kāi)放閱讀框序列，測(cè)序

6、結(jié)果顯示該序列存在2個(gè)SNP位點(diǎn)和一個(gè)突變位點(diǎn)(9523A→T)。將LF基因的開(kāi)放閱讀框序列克隆到 pcDNA3.1(-)載體中，構(gòu)建了LF基因的真核表達(dá)載體(pcLF)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將peLF導(dǎo)入5-8F細(xì)胞，G418篩選獲得抗性克隆，進(jìn)一步采用RT-PCR 檢測(cè)LF基因的mRNA表達(dá)，采用 Western Blotting檢測(cè)LF蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcLF的5-8F細(xì)胞系 (5-8F-LF)。免疫細(xì)胞化學(xué)

7、實(shí)驗(yàn)顯示表達(dá)的LF蛋白主要定位于胞漿。隨后檢測(cè)了 LF 基因穩(wěn)定表達(dá)后對(duì)5-8F細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。 流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)染pcLF后可以使5-8F-LF細(xì)胞停滯于G<,1>期，G<,1>期細(xì)胞比例增加(62．28％vs 51．81％)，S期(24．54％vs 27．80％)和G<,2>-M期細(xì)胞比例減少(13．19％vs20.38％)。 利用MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察LF基因穩(wěn)定表達(dá)后對(duì)5-8F

8、細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力的影響。MTT的結(jié)果表明5-8F-LF細(xì)胞的增殖速度明顯低于對(duì)照組 (P<0．05)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-8F-LF細(xì)胞的克隆形成率明顯低于對(duì)照組(28％ vs 54．7％)。提示 LF 基因穩(wěn)定表達(dá)后導(dǎo)致5-8F細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力降低。 本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了LF基因在慢性鼻咽炎和鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異并分析了導(dǎo)致表達(dá)差異的可能機(jī)制，結(jié)果提示 LF 基因在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)