γ-分泌酶抑制劑DAPT急性期干預(yù)Notch信號(hào)通路對(duì)新生大鼠缺血性腦損傷的作用和機(jī)制研究.pdf

1、新生兒缺血性腦損傷是由各種原因造成的新生兒局灶或廣泛性腦血流中斷，腦組織發(fā)生缺血缺氧性改變而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙。包括多種可以引起腦動(dòng)/靜脈血栓形成或栓塞的原發(fā)病因如窒息、先天性心臟病、全身性感染、休克、血液高凝狀態(tài)、嚴(yán)重失血/貧血等。近年來(lái)的臨床資料表明新生兒期缺血性腦損傷的發(fā)病率被低估并有上升趨勢(shì)，造成遠(yuǎn)期嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷。治療的核心內(nèi)容是最大程度地保留和恢復(fù)受損區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量及功能，涉及細(xì)胞凋亡/死亡、內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖

2、/分化、定植整合和血供等多個(gè)環(huán)節(jié)，受眾多細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)并協(xié)調(diào)控制。目前已知的主要信號(hào)通路包括:死亡受體通路、蛋白激酶途徑、Toll樣受體和清道夫受體CD36信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶通路（PI3K-Akt/ERK）和核因子κB通路等。
　　Notch信號(hào)通路在生物學(xué)進(jìn)化上相當(dāng)保守，通過(guò)細(xì)胞膜上配體-受體結(jié)合釋放胞內(nèi)活性片段，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的方式激活下游靶基因，實(shí)現(xiàn)相鄰細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的重要意義在于調(diào)控胚胎期的神經(jīng)

3、發(fā)育。但Notch受體及配體同樣廣泛表達(dá)于出生后至成年期的腦組織中，參與調(diào)節(jié)不同成熟階段神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化、形態(tài)可塑性、突觸可塑性和細(xì)胞命運(yùn)。因此有理由推測(cè)Notch信號(hào)通路和腦缺血損傷后的細(xì)胞應(yīng)答修復(fù)機(jī)制密切相關(guān)。成年期缺血性腦卒中的研究已經(jīng)證實(shí)缺血可誘導(dǎo)Notch信號(hào)通路發(fā)生變化、并同時(shí)產(chǎn)生加重?fù)p傷和促進(jìn)神經(jīng)再生的多種異質(zhì)性作用。這充分說(shuō)明激活的Notch信號(hào)通路在缺血后發(fā)揮的影響有著細(xì)胞種類特異性、成熟度依賴性和受具體損傷條件限

4、制的特點(diǎn)。新生兒期的腦缺血損傷具有獨(dú)特的發(fā)病因素和預(yù)后，處于不同發(fā)育階段、分布于不同腦區(qū)的各類神經(jīng)構(gòu)成細(xì)胞對(duì)于缺血打擊的耐受和反應(yīng)不完全一致，與發(fā)育成熟的大腦存在顯著差異;且目前對(duì)于Notch信號(hào)通路在新生兒缺血性腦損傷中作用尚無(wú)確切的資料，亟待進(jìn)一步的研究，或許有助于發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)治療靶點(diǎn)。
　　本研究旨在建立新生大鼠缺血性腦損傷模型，考察不同腦缺血情況下Notch信號(hào)通路變化特點(diǎn);并采用γ-分泌酶抑制劑DAPT(N-[N-(3，

5、5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-Butyl Ester）在缺血急性期干預(yù)Notch信號(hào)通路的經(jīng)典活化途徑，驗(yàn)證藥理學(xué)方法抑制缺血后該信號(hào)通路有效性;在此基礎(chǔ)上，研究DAPT對(duì)缺血損傷后腦組修復(fù)的影響以及相關(guān)的細(xì)胞現(xiàn)象和分子機(jī)制。從細(xì)胞凋亡、神經(jīng)發(fā)生、新生細(xì)胞分化、血管發(fā)生以及基因表達(dá)調(diào)控神經(jīng)發(fā)生等多角度說(shuō)明Notch信號(hào)通路在未成熟期腦缺血性損傷中的作用，為今后有效防治

6、新生兒缺血性腦卒中提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　建立新生大鼠腦缺血損傷模型，明確缺血損傷區(qū)域（缺血半影區(qū)）Notch信號(hào)通路表達(dá)變化特點(diǎn)，以及急性期應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT是否能有效抑制腦組織內(nèi)該通路活化水平;評(píng)價(jià)采用該藥理學(xué)手段干預(yù)腦內(nèi)Notch信號(hào)通路對(duì)缺血腦組織的保護(hù)作用及預(yù)后的影響;從神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)發(fā)生、遷移分化、血管發(fā)生等方面進(jìn)一步分析Notch信號(hào)通路在缺血損傷后發(fā)揮作用的可能途徑，以及涉及的相關(guān)

7、神經(jīng)發(fā)生基因表達(dá)情況。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型和藥物干預(yù):出生后10天的Sprague-Dawley大鼠(P10)分別采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立持續(xù)性全腦低灌注缺血模型（Hypoperfusion）和線栓法短暫阻斷單側(cè)大腦中動(dòng)脈建立暫時(shí)性局灶性腦缺血模型(Transient focalischemia)。兩種模型均進(jìn)一步分為缺血組和DAPT干預(yù)組，DAPT干預(yù)組在缺血1小時(shí)后腹腔注射DAPT（100mg/kg）一次

8、，缺血組則在缺血1小時(shí)后腹腔注射等量生理鹽水。對(duì)照組動(dòng)物接受假手術(shù)而不作動(dòng)脈結(jié)扎或阻斷處理。缺血術(shù)后分各時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后1天、2天、5天、7天、14天、21天、28天）測(cè)定各組大鼠體重、評(píng)估一般情況;術(shù)后第4周時(shí)，采用轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)評(píng)估大鼠腦缺血后遠(yuǎn)期的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。并于術(shù)后第5天取各組部分實(shí)驗(yàn)對(duì)象腦組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，比較Notch信號(hào)通路關(guān)鍵分子NICD、Hes1、Hes5的表達(dá)水平變化。
　　2.DAPT干預(yù)對(duì)腦缺血

9、損傷后短期存活率、梗死范圍和遠(yuǎn)期運(yùn)動(dòng)功能的影響:以缺血術(shù)后第5天為時(shí)間點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)不同組別的存活率，比較DAPT干預(yù)對(duì)短期生存的影響;取缺血后24小時(shí)的暫時(shí)性局灶性腦缺血模型腦標(biāo)本，三苯基氯化四氮唑(TTC)染色顯示梗死灶，作梗死灶大小的定量分析和比較;在缺血后第4周采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評(píng)估DAPT干預(yù)對(duì)缺血后遠(yuǎn)期運(yùn)動(dòng)功能的影響。
　　3.DAPT干預(yù)機(jī)制的分析:在不同測(cè)定時(shí)間點(diǎn)采集各組大鼠的腦組織標(biāo)本，液氮速凍后80℃低溫冷凍保存或4％多聚

10、甲醛固定做冰凍切片。缺血后24小時(shí)為觀察時(shí)間點(diǎn)，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)缺血半影區(qū)的細(xì)胞凋亡。采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)連續(xù)腹腔注射(缺血術(shù)后1小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)各一次，每次50mg/kg)后，于缺血后第5天取腦切片，免疫組化方法研究不同腦區(qū)細(xì)胞增殖水平;并采用免疫熒光雙重標(biāo)記的方法考察增殖細(xì)胞的分化特點(diǎn)和類型。取缺血后第14天的腦標(biāo)本切片作缺血半影區(qū)血管基底膜標(biāo)志物免疫熒光染

11、色，半定量分析血管發(fā)生的水平。采用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)檢測(cè)缺血后第5天時(shí)暫時(shí)性局灶性腦缺血模型半影區(qū)組織中與神經(jīng)發(fā)生及干細(xì)胞分化有關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平，并用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(qRT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.P10 SD大鼠采用雙側(cè)勁動(dòng)脈永久結(jié)扎和線栓法短暫阻斷大腦中動(dòng)脈兩種方法分別模仿持續(xù)性全腦低灌注缺血和暫時(shí)性局灶性腦缺血可以建立新生兒期缺血性腦損傷的動(dòng)物模型。缺血手術(shù)后的大鼠表現(xiàn)為活力減退

12、、體重下降，以術(shù)后1周內(nèi)最為明顯。缺血后第4周時(shí)缺血組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能受到損傷。
　　2.缺血引起腦組織內(nèi)Notch信號(hào)通路激活。缺血后第5天時(shí)兩種不同缺血模型NICD、Hes1和Hes5的蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著提高（分別為P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001）;采用急性期DAPT干預(yù)可以有效抑制該通路在缺血后的活化（P＜0.001，和缺血組相比較），NICD的水平甚至低于對(duì)照組的基礎(chǔ)水平（Hypoperfusion模型

13、24.31±5.73％，F(xiàn)ocal ischemia模型37.44±2.93％，P＜0.001）。
　　3.DAPT急性期干預(yù)提高了缺血后模型動(dòng)物的短期存活比率。缺血后第5天時(shí)，DAPT干預(yù)組的存活率明顯高于缺血組(Hypoperfusion模型:77.8％∶33.3％;Focal ischemia模型:72.7％∶33.3％,P＜0.05)。
　　4.在暫時(shí)性局灶性腦缺血模型上,急性期DAPT干預(yù)使得缺血后24小時(shí)的梗死灶

14、范圍較缺血組下降了22.26％(P＜0.001)。
　　5.急性期DAPT干預(yù)明顯改善兩種不同缺血模型缺血后第4周時(shí)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能（和缺血組相比較，P＜0.05）。
　　6.急性期DAPT干預(yù)在兩種不同缺血模型上均能減少缺血后24小時(shí)的缺血半影區(qū)細(xì)胞凋亡的發(fā)生（P＜0.001）。
　　7.缺血發(fā)生后第5天，兩種不同缺血模型的梗死灶周邊移行區(qū)增殖細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），DAPT干預(yù)進(jìn)一步提高這種新生細(xì)胞的

15、聚集現(xiàn)象（P＜0.05，和缺血組相比）。與之相反的，側(cè)腦室下區(qū)的增殖細(xì)胞密度受到缺血的抑制（P＜0.05，和對(duì)照組相比），DAPT則能逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)（P＜0.05，和缺血組相比）。
　　8.在暫時(shí)性局灶性腦缺血模型的缺血半影區(qū)內(nèi)，DAPT提高了缺血后第5天時(shí)Nestin+/BrdU+共定位細(xì)胞比例，同時(shí)降低了Iba1+/BrdU+共定位細(xì)胞比例（P＜0.05，和缺血組比較）。
　　9.DAPT干預(yù)提高了缺血后14天時(shí)暫時(shí)性局灶

16、性腦缺血模型半影區(qū)的血管密度（P＜0.05，和缺血組比較）。
　　10.在暫時(shí)性局灶性腦缺血模型上，基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示缺血和DAPT兩種因素都會(huì)引起和神經(jīng)發(fā)生、干細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)水平變化。DAPT干預(yù)誘導(dǎo)了7種新的基因表達(dá)（對(duì)照組和缺血組均陰性），顯著上調(diào)了其他2種基因的表達(dá)（對(duì)照組陽(yáng)性，和缺血組相比變化倍數(shù)＞1.5）;同時(shí)重新沉默了4種基因的表達(dá)（對(duì)照組陰性而缺血組陽(yáng)性），并顯著下調(diào)了其他11種基因的表達(dá)（對(duì)照組陽(yáng)性，和

17、缺血組相比變化倍數(shù)＞1.5）。表達(dá)水平上調(diào)和被誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物主要和細(xì)胞增殖、突觸功能、細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)錄因子以及G-蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路有關(guān)，而表達(dá)下調(diào)的基因則與G-蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞遷移/黏附、轉(zhuǎn)錄/生長(zhǎng)因子等細(xì)胞動(dòng)能有關(guān)。qRT-PCR檢測(cè)對(duì)7種組間變化倍數(shù)＞1.5倍的基因mRNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析，所得到的變化趨勢(shì)和在基因芯片上觀察到的相一致。
　　結(jié)論:
　　1.新生未成熟腦發(fā)生缺血性損傷可以激活N

18、otch信號(hào)通路。采用γ-分泌酶抑制劑DAPT急性期干預(yù)可以有效抑制該通路的活化水平。
　　2.DAPT急性期抑制Notch信號(hào)通路提高新生兒期未成熟腦缺血性損傷后的短期存活率，縮小局灶性缺血模型的梗死范圍，并改善遠(yuǎn)期的運(yùn)動(dòng)功能。
　　3.新生兒期未成熟腦缺血后DAPT抑制Notch信號(hào)通路所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、調(diào)控分化、促進(jìn)增殖細(xì)胞在受損區(qū)域聚集及血管發(fā)生有關(guān)。
　　4.缺血后DAPT急性