新生鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血性腦損傷后μ-Calpain的活性變化及其抑制劑的腦保護(hù)作用研究.pdf

1、目的 觀察新生鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血性腦損傷(HIBD)后腦組織中μ-calpain mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，研究caspase-3活性亞單位及凋亡細(xì)胞的變化規(guī)律，并觀察予calpain抑制劑-3(MDL28170)干預(yù)后對(duì)上述指標(biāo)的影響，探討其對(duì)HIBD后腦的作用及作用機(jī)制。 方法 建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，觀察腦組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化，計(jì)數(shù)海馬CAl區(qū)神經(jīng)元死亡數(shù)；采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)損傷側(cè)

2、腦組織中μ-calpain mRNA的變化，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)μ-calpain活化蛋白質(zhì)的表達(dá)；免疫印跡及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)caspase-3活性亞單位的變化，脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的變化；并予calpain抑制劑-3干預(yù)，檢測(cè)上述指標(biāo)的變化。 結(jié)果 1．HIBD后大鼠出現(xiàn)不同程度行為能力障礙，大體觀察見(jiàn)腦組織充血水腫、梗死灶形成，HE染色見(jiàn)神經(jīng)元腫脹、變性、丟失，排列紊亂，膠質(zhì)細(xì)胞

3、增生；電鏡下可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞器腫脹，核糖體減少，核染色質(zhì)分布不均、固縮，核崩解；HI后24h海馬CAl區(qū)神經(jīng)元明顯減少，與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.01)。 2．與對(duì)照組比較，HIBD后6h損傷側(cè)腦組織μ-calpain mRNA開始增高，24h到達(dá)高峰(p<0.05)，48-72h下降，但是仍然高于對(duì)照組(p<0.05)；μ-calpain蛋白質(zhì)的活性片段在HI后6-12h表達(dá)明顯增高(p<0.05)，24h達(dá)到高峰(p<0.

4、01)，48-72h仍處于較高水平(p<0.05)。 3．HI后caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，免疫印跡顯示其活性片段在HIBD后6h開始增加，24h達(dá)到高峰(p<0.01)，48h開始下降，72h降至對(duì)照組水平；caspase-3阻性細(xì)胞數(shù)在HI后48h達(dá)到高峰，72h下降，但仍明顯高于對(duì)照組(p<0.01)。 4．HIBD大鼠損傷側(cè)大腦皮質(zhì)及海馬CAl區(qū)凋亡細(xì)胞隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，分別于24h及4

5、8h達(dá)到高峰，72h仍處于較高水平，與對(duì)照組之間有顯著性差異(p<0.01)。 5．給予calpain抑制劑-3(MDL28170)干預(yù)后，干預(yù)組大鼠μ-calpain蛋白質(zhì)表達(dá)、caspase-3蛋白條帶及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)均較同時(shí)間點(diǎn)HIBD組減少(p<0.05)；MDL28170雖然能減少μ-calpain mRNA的表達(dá)量，但與HIBD組相比差異不明顯(p>0.05)。 結(jié)論 1．新生鼠HIBD時(shí)μ-

6、calpain mRNA及蛋白質(zhì)水平顯著增高，與對(duì)照組差異明顯，提示μ-calpain可能參與了缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生。 2．Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)在HI后明顯增高，且與凋亡細(xì)胞數(shù)的增加呈同相變化，證實(shí)HIBD中存在細(xì)胞凋亡，與caspase-3水平增高密切相關(guān)。 3．Calpain抑制劑-3(MDL28170)能顯著降低μ-calpain及caspase-3的表達(dá)，減少凋亡細(xì)胞數(shù)目，提示其具有腦保護(hù)作用，這種作用