核苷酸類藥物與小分子或蛋白質(zhì)相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應(yīng)用研究.pdf

1、共振瑞利散射(RRS)與共振非線性散射(RNLS)是二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的新的分析技術(shù)。因其靈敏度高，實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單，且方法快速簡便而越來越受到人們的關(guān)注。而且生物大分子的研究和測定方面更表現(xiàn)了它的優(yōu)越性，但是目前該技術(shù)對核苷酸及煙酰胺輔酶這類生物小分子的研究甚少。因此，本文以核苷酸及輔酶為主要的研究對象，研究它們與金屬離子和染料的相互作用。發(fā)展了用RRS法測定某些核苷酸和輔酶新方法。同時也研究了某些輔酶與生物大分子蛋白質(zhì)之間的作用，

2、發(fā)展了RRS法與RNLS法測定輔酶，蛋白質(zhì)的新方法。文中還利用共振瑞利散射光譜，結(jié)合吸收光譜和熒光光譜的變化對相關(guān)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了探討。 1．鈰(Ⅳ)與腺嘌呤核苷酸相互作用的共振瑞利散射光譜研究及其分析應(yīng)用。 用共振瑞利散射光譜研究了Ce(Ⅳ)與腺苷-5’—一磷酸(AMP)、腺苷-5’—二磷酸(ADP)、腺苷-5’—三磷酸(ATP)等腺嘌呤核苷酸之間的相互作用。結(jié)果表明，在pH2.0-3.0左右的Walpole緩沖溶液中，

3、Ce(Ⅳ)及核苷酸自身的共振瑞利散射(RRS)均十分微弱，當(dāng)它們相互作用形成復(fù)合物后將導(dǎo)致RRS顯著增強(qiáng)并出現(xiàn)新的RRS光譜。不同的腺嘌呤類核苷酸與Ce(Ⅳ)結(jié)合產(chǎn)物具有相似的RRS光譜特征，最大散射峰均位于358nm處并于540nm附近有一較小的散射峰，但散射強(qiáng)度有一定的差異，其相對散射強(qiáng)度順序?yàn)锳MP＞ADP＞ATP。在一定范圍內(nèi)，腺嘌呤核苷酸濃度與散射強(qiáng)度成正比，檢出限分別為2.08ngmL-1(AMP)、2.28ngmL-1(A

4、DP)和3.63ngmL-1(ATP)，據(jù)此建立了一種以Ce(Ⅳ)離子為探針RRS法測定腺嘌呤核苷酸的新方法。本文討論了Ce(Ⅳ)和腺嘌呤核苷酸反應(yīng)的最佳條件及影響因素，實(shí)驗(yàn)了共存物質(zhì)的影響，表明方法有較好的選擇性。文中還探討Ce(Ⅳ)與ATP的結(jié)合模式及散射增強(qiáng)的原因。 2．煙酰胺輔酶與維多利亞藍(lán)4R相互作用的吸收、熒光和共振瑞利散射光譜及其分析應(yīng)用研究。 在pH7.2的Britton—Robinson(BR)緩沖溶液

5、中，輔酶Ⅰ(NAD+)、輔酶Ⅱ(NADP+)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)和還原型輔酶Ⅱ(NADFH)等煙酰胺輔酶與陽離子染料維多利亞藍(lán)4R(VB4R)之間能通過靜電引力和疏水作用力形成電中性離子締合物，此時不僅能引起維多利亞藍(lán)4R的褪色反應(yīng)，而且能導(dǎo)致共振瑞利散射(RRS)顯著增強(qiáng)和NADH的熒光猝滅。其最大褪色波長均位于611nm處，但褪色程度的順序是NADPH＞NADH＞NADP+＞NAD+。4種輔酶反應(yīng)產(chǎn)物也具有類似的RRS光譜特征

6、，最大散射波長分別位于521nm(NAD+，NADP+)，524nm(NADH)，526nm(NADPH)。但它們的相對散射強(qiáng)度有較大的差異，并以NADPH＞NADH＞NADP+＞NAD+的順序降低。不論吸光度降低(△A)或散射增強(qiáng)(△I)均在一定范圍內(nèi)與輔酶的濃度成線型關(guān)系。這就為用褪色分光光度法和RRS法測定這類輔酶，特別是還原型輔酶創(chuàng)造了條件。文中重點(diǎn)討論了反應(yīng)體系的RRS光譜特征，用RRS法測定輔酶的適宜條件和影響因素，并考察了

7、共存物質(zhì)對測定的影響，表明方法有良好的選擇性。據(jù)此發(fā)展了一種用RRS技術(shù)高靈敏測定這類輔酶的新方法。文中還結(jié)合吸收光譜和熒光光譜的變化對反應(yīng)機(jī)理和散射增強(qiáng)的原因進(jìn)行了討論。 3．鈀(Ⅱ)—輔酶—木瓜蛋白酶反應(yīng)體系共振瑞利散射法測定某些煙酰胺輔酶。 在pH4.4-4.6的Britton—Robinson(BR)緩沖溶液中，輔酶Ⅰ(NAD+)，輔酶Ⅱ(NADP+)及還原型輔酶NADH和NADPH四種煙酰胺類輔酶能與Pd(Ⅱ)

8、能形成1：1的螯合物，當(dāng)它們進(jìn)一步與木瓜蛋白酶反應(yīng)形成1：1：1的三元復(fù)合物時，能引起共振瑞利散射(RRS)顯著增強(qiáng)并出現(xiàn)新的RRS光譜。4種反應(yīng)產(chǎn)物具有相似的RRS光譜特征，在300-600nm之間有一個寬的散射帶，并在309nm和550nm附近有兩個散射峰。在一定濃度范圍內(nèi)，散射增強(qiáng)(△I與輔酶的濃度成正比，反應(yīng)具有高靈敏度。對于不同輔酶的檢出限在(2.35-3.33)×10-8molL-1之間，可用于微量煙酰胺類輔酶的測定。本文研

9、究了適宜的反應(yīng)條件和影響因素，考察了共存物質(zhì)的影響，表明方法有較好的選擇性。據(jù)此發(fā)展了一種用RRS技術(shù)靈敏，簡便和快速測定上述輔酶的新方法。 4．鈀(Ⅱ)與還原型輔酶Ⅰ和溶菌酶相互作用的熒光和共振瑞利散射光譜研究。 在pH4.6BR緩沖溶液中，NADH與Pd(Ⅱ)和溶菌酶結(jié)合后，不僅能引起溶菌酶熒光光譜的顯著猝滅，更能導(dǎo)致共振瑞利散射(RRS)的顯著增強(qiáng)。最大RRS波長位于309nm，其RRS增加程度與NADH的含量呈正

10、比，對NADH的線性范圍在(0.26-31.25)×10-7molL-1之間，最低檢出限可達(dá)5.7ngmL-1。而當(dāng)NADH過量時，RRS的增加程度與溶菌酶的濃度在(0.035-4.2)×10-7molL-1的范圍內(nèi)呈正比，對溶菌酶的檢出限可達(dá)15.1ngmL-1。RRS光譜為研究生物分子與金屬配合物之間相互作用提供了新的信息，也為高靈敏測定這些生物大分子與小分子創(chuàng)造了條件。文中還通過考察溶菌酶在NADH與Pd(Ⅱ)存在下所發(fā)生的熒光猝

11、滅，以及NADH在溶菌酶及Pd(Ⅱ)存在下所發(fā)生的熒光猝滅，研究了它們的熒光猝滅類型，并探討了Pd(Ⅱ)與NADH及溶菌酶的結(jié)合模式及反應(yīng)機(jī)理。 5．鈀(Ⅱ)—NADP與幾種蛋白質(zhì)體系的共振瑞利散射光譜和共振非線性散射光譜及其分析應(yīng)用。 在pH4.0-5.0的Britton—Robinson(BR)緩沖溶液中，NADP與Pd(Ⅱ)能形成螯合陰離子，它能進(jìn)一步與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血紅蛋白(HG

12、B)及γ—球蛋白(γglobin)相互作用，引起共振瑞利散射(RRS)、二級散射(SOS)和倍頻散射(FDS)不同程度的增加。其增加強(qiáng)度為牛血清白蛋白＞人血清白蛋白＞血紅蛋白＞γ—球蛋白。4種蛋白質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物有相似的散射光譜特征，最大的RRS，SOS，F(xiàn)DS波長分別位于333nm，500nm，250nm附近。在一定范圍內(nèi)，散射強(qiáng)度的增加(△IRRS，△ISOS，△IFDS)與各種蛋白質(zhì)濃度的增加均有很好的線型關(guān)系，可用于幾種蛋白質(zhì)的定量