臨床分離嗜麥芽窄食單胞菌喹諾酮耐藥基因、產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶耐藥基因的研究.pdf

1、目的：
　　嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，Sm）屬于非發(fā)酵菌，是一種專性需氧的G－桿菌，廣泛存在于自然界，如：各種水源、牛奶、土壤、動(dòng)物及人體等；醫(yī)院環(huán)境如透析裝置、中心動(dòng)/靜脈壓檢測(cè)儀、霧化吸入、人工呼吸裝置及通氣管道等亦可分離到該菌。近10年來(lái)，Sm臨床分離率呈明顯上升趨勢(shì)，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，可引起肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、蜂窩組織炎、尿道及傷口感染、菌血癥及敗血癥等；該菌

2、對(duì)多種廣譜抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來(lái)很大困難。因此，對(duì)其耐藥機(jī)制、耐藥基因的傳播與轉(zhuǎn)移的研究已引起廣泛關(guān)注，成為近年來(lái)該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　本課題通過(guò)對(duì)喹諾酮耐藥基因Smqnr、產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶基因APH(3’’)-Ⅰ和AAC(2’)-Ⅰ的克隆測(cè)序及表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行Smqnr蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的結(jié)晶試驗(yàn)提供必須材料，同時(shí)為了解上述基因表達(dá)產(chǎn)物的特性及功能奠定基礎(chǔ)，從分子水平開(kāi)展醫(yī)院Sm耐藥株感染的控制和監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

3、　　方法：
　　采用離心柱型DNA抽提純化試劑盒提取Sm染色體DNA，根據(jù)Genbank公布的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以染色體DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增Smqnr、APH(3’’)-Ⅰ和AAC(2’)-Ⅰ全基因，PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a,挑取經(jīng)氨芐篩選的陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒并經(jīng)雙酶切鑒定及進(jìn)行測(cè)序。以證實(shí)含目的基因的質(zhì)粒DNA為模板大量擴(kuò)增目的基因并將其亞克隆入高效原核融合

4、蛋白（GST）表達(dá)載體pGEX-4T-1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21,經(jīng)雙酶切鑒定后以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡法（Western blot）分析表達(dá)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　以染色體DNA為模板，PCR擴(kuò)增出三個(gè)大小分別約650bp、800bp和520bp左右的片段并將其成功克隆入T載體。序列比對(duì)分析顯示Smqnr開(kāi)放閱讀框

5、長(zhǎng)660bp，編碼24.3kDa蛋白；APH(3’’)-Ⅰ開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)813bp，編碼29.9kDa蛋白；AAC(2’)-Ⅰ開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)549bp，編碼20.2kDa蛋白。三個(gè)基因的序列已登錄GenBank，登錄號(hào)分別為HQ315851、HQ315852和HQ315853。成功構(gòu)建高效表達(dá)載體pGEX-4T-1-Smqnr/ APH(3’’)-Ⅰ/AAC(2’)-Ⅰ，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別獲得分子量約50kDa、56kDa、46kDa的融合