Serratia plymuthica硝吡咯菌素prnABCD操縱子的研究.pdf

1、硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin,PRN)是色氨酸衍生的有機(jī)鹵代次級(jí)代謝物,具有廣譜抗真菌活性,已經(jīng)用于臨床治療人類(lèi)皮膚真菌感染疾病。另外PRN的衍生物苯吡咯(Phenylpyrrole)被用作農(nóng)業(yè)殺菌劑,抑制多種植物病原真菌包括立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)等生長(zhǎng)。普城沙雷氏菌Serratia plymuthicaG3是典型的生防菌,通過(guò)合成PRN、胞外酶等多種抗真菌代

2、謝物抑制植物病原菌的生長(zhǎng)。
　　 本研究以S.plymuthicaG3為模式細(xì)菌,首先分子克隆并在大腸桿菌Escherichia coli中異源表達(dá)了硝吡咯菌素prnABCD基因簇。利用同源重組技術(shù),構(gòu)建了S.plymuthica的prnA基因缺失突變菌株和IPTG誘導(dǎo)的prnind條件突變菌株(利用lacQPtac啟動(dòng)子構(gòu)建了prnind,不添加IPTG時(shí)是prn突變菌株;添加IPTG時(shí)是過(guò)表達(dá)菌株)。通過(guò)平板對(duì)峙及TLC檢測(cè)

3、比較野生菌株G3及其衍生菌株的硝吡咯菌素產(chǎn)量變化和抑菌作用;以及PRN表達(dá)水平對(duì)其它生防表型的影響。應(yīng)用lux-和lacZ-報(bào)告基因融合的策略,分析了小RNARsmB對(duì)硝吡咯菌素生物合成的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)分子克隆并在大腸桿菌E.coli中異源表達(dá)了G3菌株硝吡咯菌素prnABCD基因簇(基因登錄號(hào):JF274257),表明prnABCD負(fù)責(zé)合成PRN。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),S.plymuthicaG3pr

4、nABCD基因與其它沙雷氏菌屬Serratia_sp.AS12、Serratia_sp.AS13和S.plymuthicaAS9中prnABCD同源基因親緣關(guān)系最密切,遺傳進(jìn)化距離最近。
　　 (2)構(gòu)建了prnA缺失突變菌株及其prnind條件突變菌株,通過(guò)平板對(duì)峙發(fā)現(xiàn)△prn突變體幾乎完全喪失抗真菌活性,而prnind菌株在添加IPTG誘導(dǎo)后抗真菌活性恢復(fù)到比野生菌更強(qiáng)的水平;另外TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)△prn菌株幾乎不合成PRN,

5、prnind菌株在IPTG誘導(dǎo)條件下合成PRN的量明顯多于野生型。
　　 (3)通過(guò)G3/prnA::lux、△rsmB/prnA::lux的轉(zhuǎn)錄融合和G3/prnA::lacZ、△rsmB/prnA::lacZ的翻譯融合分析,發(fā)現(xiàn)突變體的生物發(fā)光及β-半乳糖甘酶活性均低于野生菌,表明RsmB分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與正向調(diào)控PRN的生物合成,盡管調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
　　 以上結(jié)果說(shuō)明S.plymuthicaG3