Serratia plymuthica Hfq功能分析與SptIR群體感應(yīng)系統(tǒng)的初步鑒定.pdf

1、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3分離自小麥內(nèi)莖,是一種能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和硝吡咯菌素(PRN)等多種抗真菌因子的內(nèi)生細(xì)菌。Hfq是細(xì)菌中相對(duì)保守的RNA結(jié)合蛋白,主要在轉(zhuǎn)錄后水平上全局調(diào)控細(xì)菌基因的表達(dá)。在革蘭氏陰性細(xì)菌中,群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由LuxI／R同源物組成,通過(guò)分泌擴(kuò)散性小分子信號(hào)酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs),以種群密度依賴的方式在轉(zhuǎn)錄水平全局調(diào)控基因表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)菌生理和行為以適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。<

2、br>　　 本研究以S.plymuthica G3為模式細(xì)菌,一方面在已獲得的hfq基因突變體的基礎(chǔ)上,采用基于lux-或lacZ-報(bào)告基因融合的策略和TLC等檢測(cè)方法,分析了Hfq對(duì)PRN和IAA生物合成的影響,以及自我調(diào)控；另一方面通過(guò)構(gòu)建突變體和互補(bǔ)菌株分析等策略,初步鑒定了S.plymuthica G3菌株的第三個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)及其調(diào)控的生防相關(guān)表型。
　　 主要結(jié)論如下:
　　 1.hfq的功能分析:
　

3、　 (1)基于G3／prnA∷lux和△hfq／prnA∷lux的轉(zhuǎn)錄融合分析發(fā)現(xiàn),△hfq／prnA∷lux的生物發(fā)光明顯低于G3／prnA∷lux,表明Hfq對(duì)prnA在轉(zhuǎn)錄有一定的影響；同時(shí)基于G3／prnA∷lacZ和△hfq／prnA∷lacZ的翻譯融合分析,與野生菌比較,△hfq／prnA∷lacZ菌株的β-半乳糖甘酶活性處于很低的水平。與轉(zhuǎn)錄水平比較,轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用更為明顯。
　　 (2)基于TLC分析G3

4、和△hfq菌株中硝吡咯菌素的提取物,證實(shí)了prnABCD操縱子的表達(dá)是Hfq依賴的；與野生菌G3相比,△hfq突變株幾乎喪失了產(chǎn)生PRN的能力,通過(guò)TLC分析在不可檢測(cè)水平。
　　 (3)構(gòu)建了G3／rpos∷lacZ、△hfq／rpos∷lacZ菌株,通過(guò)β-半乳糖甘酶活性分析發(fā)現(xiàn)△hfq／rpos∷lacZ的半乳糖甘酶活性明顯低于野生菌株,表明Hfq也是可變?chǔ)乙蜃覴poS翻譯所必需的。
　　 (4)通過(guò)比較分析G3和

5、△hfq菌株產(chǎn)生的吲哚乙酸(IAA),發(fā)現(xiàn)Hfq還正向調(diào)控IAA的產(chǎn)生。
　　 (5)通過(guò)構(gòu)建G3／hfq∷lacZ和△hfq／hfq∷lacZ菌株,發(fā)現(xiàn)Hfq還是一個(gè)正向自我調(diào)控子,與大腸桿菌E.coli中Hfq作為自我翻譯的抑制子不同。
　　 (6)分析蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)數(shù)期G3租△hfq菌株的全細(xì)胞蛋白表達(dá)譜,共發(fā)現(xiàn)194個(gè)差異點(diǎn),經(jīng)質(zhì)譜鑒定了110個(gè)差異蛋白:以野生型作為對(duì)照,其中表達(dá)下調(diào)點(diǎn)有80個(gè),上調(diào)點(diǎn)有30個(gè)

6、。其中57個(gè)是與參與細(xì)胞代謝相關(guān)的蛋白,26個(gè)參與細(xì)胞加工和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),18個(gè)參與信息儲(chǔ)藏與修飾的蛋白有關(guān)。
　　 2.通過(guò)生物信息學(xué)分析和PCR擴(kuò)增,克隆了菌株G3中第3個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)SptI／R。進(jìn)一步經(jīng)突變和功能分析,初步鑒定SptR是一個(gè)正調(diào)控子。
　　 以上結(jié)果說(shuō)明Hfq和SptR作為S.plymuthica內(nèi)生菌株G3的2個(gè)全局調(diào)控子可在轉(zhuǎn)錄后和轉(zhuǎn)錄水平上影響細(xì)菌多種生理活動(dòng),并與生防能力和植物生長(zhǎng)促進(jìn)水平