枯草桿菌生物素操縱子基因的克隆與功能表達研究.pdf

1、該研究以大腸桿菌(E.coli)克隆載體pUC19為模板,分別用兩對引物擴增了含有復制起始序列(ori)和復制蛋白基因(rep)的700bp片段,以枯草芽孢桿菌(B.subtilis)質粒載體pGDV1為基本骨架,構建了三個帶有氯霉素抗性基因的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌小型穿梭載體pGDVM、pGDVM1和pGDVM2.經(jīng)大腸桿菌-枯草桿菌反復穿梭實驗和細菌連續(xù)培養(yǎng)分析檢測,結果證明:含大腸桿菌pUC19復制起始區(qū)(ori)和復制起始蛋白基

2、因(rep)的700bp克隆片段在大腸桿菌中具有完全的復制功能;構建的三個質粒載體在大腸桿菌和枯草桿菌中能穩(wěn)定地遺傳.這三個穿梭質粒載體分子較小,僅3kb左右;具有較高的拷貝數(shù)(在枯草桿菌中約150-200拷貝數(shù)),帶有多個不同的克隆位點,方便插入目標基因,并且?guī)в新让顾乜剐曰?可以為受體菌提供理想的抗性篩選標記.該系列載體可以作為枯草桿菌理想的基因工程菌構建骨架.該研究成功地克隆了枯草桿菌生物素操縱子基因bioB、bioW和基因簇b

3、ioWAFDB片段;以大腸桿菌表達質粒載體pEXT20為骨架,分別構建了bioW、bioB和bioWAFDB誘導型表達載體pEXT20bioW、pEXT20bioB和pEXT20bioWAFDB,可以通過IPTG誘導,在大腸桿菌中進行表達.通過它們與大腸桿菌生物素生物合成基因系列bioF、bioB、bioC、bioD和bioA缺陷株R874、R875、R876、R877和R879的遺傳互補實驗,證明:枯草桿菌生物素基因bioA、bioB

4、、bioD和bioF在大腸桿菌中功能正常;bioW基因(編碼庚二酰CoA合成酶)的表達載體對大腸桿菌缺陷株沒有遺傳互補作用,但是bioW基因編碼的庚二酰CoA合成酶在大腸桿菌中有催化活性,可以催化外源的庚二酸合成庚二酰CoA,為生物素合成途徑提供底物.經(jīng)過IPTG不同水平的誘導表達實驗,發(fā)現(xiàn):枯草桿菌生物素基因bioWAFDB的過量表達對受體菌的生長有嚴重抑制作用,該抑制作用主要是由bioW引起,并且不能通過添加二氨基庚二酸而解除.枯草