腸炎沙門菌轉(zhuǎn)錄因子SEN2967和SEN3610調(diào)控基因的篩選與鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis,S.Enteritidis,SE)是革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌,對人類和動物都具有致病性,是重要的人獸共患病原菌。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)是一類能夠結(jié)合在特定基因上游特異核苷酸序列上的蛋白,并能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控細(xì)菌毒力因子的表達(dá),參與生理生化代謝過程,因此對沙門菌轉(zhuǎn)錄因子的研究對于沙門菌致病機(jī)制與防控

2、研究都具有重要意義。本實驗室前期研究中利用SCOTS技術(shù)篩選腸炎沙門菌感染禽源巨噬細(xì)胞HD-11的過程中表達(dá)的基因,兩個候選轉(zhuǎn)錄因子SEN2967和SEN3610基因的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平顯著高于體外培養(yǎng)狀態(tài)下的表達(dá)水平,但國內(nèi)外對這兩個假定轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究未見報道。
  本研究通過同源重組的方法成功構(gòu)建了腸炎沙門菌SEN2967和SEN3610基因缺失株及其誘導(dǎo)型表達(dá)株;并通過雙向電泳、iTraQ技術(shù)對二者調(diào)控的基因表達(dá)進(jìn)行了分析;對

3、于篩選獲得的基因,采用EMSA進(jìn)行驗證。
  1.腸炎沙門菌C50041轉(zhuǎn)錄因子SEN2967和SEN3610的缺失株與表達(dá)株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定
  利用熒光定量PCR比較腸炎沙門菌C50041感染HD-11細(xì)胞5h后與體外培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異,證實SEN2967上調(diào)約98倍,SEN3610上調(diào)約15倍。本研究利用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了腸炎沙門菌缺失株C50041ΔSEN2967、C50041ΔSEN

4、3610*pBad24及以pBad24為載體的誘導(dǎo)型表達(dá)株C50041ΔSEN2967(pBad24-SEN29673*Flag)、C50041ΔSEN3610(pBad24-SEN36103*Flag)。Western Blot結(jié)果顯示,誘導(dǎo)型表達(dá)株中SEN2967和SEN3610蛋白經(jīng)誘導(dǎo)后均成功表達(dá)。生物學(xué)特性結(jié)果表明,SEN2967和SEN3610的缺失均不影響腸炎沙門菌的生理生化特性;小鼠體內(nèi)競爭實驗表明,SEN2967和SE

5、N3610缺失株的致病力均明顯低于野生株C50041。腸炎沙門菌SEN2967和SEN3610基因缺失株和誘導(dǎo)型表達(dá)株的成功構(gòu)建為后期篩選SEN2967和SEN3610調(diào)控的基因表達(dá)研究提供了相應(yīng)的生物材料。
  2.腸炎沙門菌C50041轉(zhuǎn)錄因子SEN2967和SEN3610的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
  本研究通過雙向電泳分析SEN2967和SEN3610缺失株與表達(dá)株的蛋白表達(dá)水平差異。分別提取SEN2967和SEN3610的缺

6、失株和表達(dá)株的全菌蛋白,在確保上樣量一致的前提下,進(jìn)行雙向凝膠電泳,銀染后掃描獲得2D圖譜,經(jīng)PD Quest軟件分析,檢測出SEN2967的缺失株和表達(dá)株有56個差異蛋白點,檢測出SEN3610的缺失株和表達(dá)株有91個差異蛋白點。隨后我們利用iTraQ技術(shù)檢測缺失株與表達(dá)株中表達(dá)差異的蛋白譜,在差異倍數(shù)≥1.5或者≤0.67倍,P值≤0.05的條件下,SEN2967缺失株與誘導(dǎo)型表達(dá)株相比,上調(diào)表達(dá)的蛋白有81個,下調(diào)表達(dá)的蛋白有90

7、個,共計差異數(shù)量171; SEN3610缺失株與表達(dá)株相比,上調(diào)表達(dá)的蛋白有25個,下調(diào)表達(dá)的蛋白有21個,共計差異數(shù)量46。這一結(jié)果與雙向電泳均表明SEN2967和SEN3610基因的缺失或誘導(dǎo)表達(dá)可以引起細(xì)菌中其它蛋白表達(dá)的變化。iTraQ結(jié)果進(jìn)一步顯示,在SEN2967和SEN3610缺失株中下調(diào)表達(dá)的蛋白庫中存在與T3SS緊密相關(guān)的蛋白,主要包括SPI-1和SPI-5的效應(yīng)蛋白,以及與針狀結(jié)構(gòu)形成相關(guān)的蛋白。選擇部分與T3SS相

8、關(guān)且表達(dá)量差異明顯的蛋白表達(dá)基因,利用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異,結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平的表達(dá)并非平行關(guān)系。本研究篩選獲得的蛋白為進(jìn)一步研究SEN2967和SEN3610在腸炎沙門菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中參與的信號通路奠定了基礎(chǔ)。
  3.腸炎沙門菌C50041轉(zhuǎn)錄因子SEN3610調(diào)控基因的EMSA驗證
  為了篩選和鑒定轉(zhuǎn)錄因子SEN3610直接調(diào)控的基因,我們利用EMSA實驗來檢測轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控的基因啟動子之間的

9、相互作用。首先利用pMAL-5載體成功構(gòu)建了SEN3610原核表達(dá)載體,獲得重組菌株、E.coli ER2523(pMAL-c5X-SEN3610)和E.coli ER2523(pMAL-p5X-SEN3610);純化回收MBP-SEN3610融合蛋白約40 mg,并經(jīng)透析后用于EMSA實驗。根據(jù)第二章篩選獲得的基因序列,分別定位其啟動子序列,通過兩級PCR合成5'FAM熒光標(biāo)記的探針。在EMSA反應(yīng)體系下驗證SEN3610與各探針的結(jié)

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