肝X受體β在小鼠炎性疼痛中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　疼痛是由于傷害性刺激或組織損傷引起的不愉快的感官體驗(yàn)。肝X受體（LXRα和β）屬于核受體超家族，它們是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。它們的配體是氧化膽固醇的代謝產(chǎn)物，它們參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝基因。LXRs有2個亞型，LXRα主要表達(dá)在肝臟中，而LXRβ則全身多系統(tǒng)廣泛表達(dá)，并在免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)具有關(guān)鍵作用。LXRα敲除小鼠不會造成基本發(fā)育缺陷，而LXRβ缺失小鼠則會引起大腦皮層腦回受損，將會導(dǎo)致放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(RGC

2、)發(fā)育失常，最終引起胚胎發(fā)育期間新生神經(jīng)元的遷移障礙。研究證實(shí)，LXRβ敲除(KO)小鼠大腦皮層放射狀膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞會出現(xiàn)異常。LXRβ與多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)，LXRβ的缺失增加肌萎縮性側(cè)索硬化癥-帕金森氏癡呆的風(fēng)險。LXRβ特異性的在脊髓灰質(zhì)的神經(jīng)元和白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的亞群表達(dá)。LXRβ缺失雄性小鼠成年后出現(xiàn)運(yùn)動神經(jīng)元變性。研究證實(shí)，LXRβ激活后，對脊髓損傷可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。這些最新的研

3、究表明，LXRβ為CNS的正常功能是必不可少的。目前的研究顯示，LXRβ對疼痛調(diào)制的確切作用尚未闡明，LXRβ誘發(fā)的感覺過敏的分子機(jī)制是不確定的。對LXR調(diào)制痛覺過敏的細(xì)胞和分子機(jī)制的研究可為的臨床治療藥物的開發(fā)提供新的策略。
　　方法：
　　1.觀察LXRβ在與痛覺調(diào)制相關(guān)區(qū)域的表達(dá)，及其與疼痛在脊髓水平傳導(dǎo)通路的關(guān)系。
　　2.觀察LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠痛行為行為學(xué)改變，明確LXRβ敲除小鼠痛行為的改變，及L

4、XRβ對不同疼痛類型（熱痛和機(jī)械痛）的影響。
　　3.建立福爾馬林痛模型，觀察LXRβ對炎性疼痛的調(diào)控，進(jìn)行痛行為評分，評價量效關(guān)系，并觀察福爾馬林疼痛模型中，LXRβ敲除小鼠對比野生型小鼠表型改變對外周炎癥的影響，以及評價分析炎性疼痛刺激情況下LXRβ對脊髓痛覺調(diào)制通路上脊髓背角神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞激活的狀態(tài)的影響。
　　4、Western blot定量分析對比6-7月齡野生型與LXRβ基因敲除小鼠脊髓pERK的水平，探討LX

5、Rβ對炎性疼痛的調(diào)控的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.LXRβ在野生型小鼠的足底炎癥組織及脊髓L3-L5節(jié)段均有表達(dá)。
　　2.哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中LXRβ敲除小鼠熱縮足反射潛伏期（4.12±0.08秒）與野生型小鼠（6.26±0.13秒;p＜0.01）相比熱縮足潛伏期顯著縮短。在熱板實(shí)驗(yàn)中，與野生型小鼠熱板致痛潛伏期（7.52±0.28秒;p＜0.01）相比，LXRβ敲除小鼠（4.65±0.18秒）反應(yīng)潛伏期顯著下降。使用v

6、on Frey纖維絲測定機(jī)械痛閾值，LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠在無害的機(jī)械刺激下，響應(yīng)閾值沒有差別。這些數(shù)據(jù)表明，LXRβ參與基礎(chǔ)熱痛閾調(diào)節(jié)，而對機(jī)械痛基礎(chǔ)痛閾則無調(diào)節(jié)作用。
　　3.福爾馬林足底注射后檢測了LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足爪TNF-α，IL-1β、IL-6和NF-κB的水平，以及對注射足足爪腫脹程度進(jìn)行檢測評估。LXRβ缺失顯著增加福爾馬林誘導(dǎo)的足爪炎性因子TNF-α和IL-1β的水平，但是IL-6水平?jīng)]有改變。

7、LXRβ的缺失增加福爾馬林誘導(dǎo)的足爪組織的NF-κB的表達(dá)。LXRβ缺失后出現(xiàn)以下福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠足底組織水腫程度與野生型小鼠相比，在第1小時和第2小時兩個時間點(diǎn)均顯著增加。這些結(jié)果表明，LXRβ缺失誘導(dǎo)的炎癥疼痛超敏反應(yīng)與NF-κB相關(guān)的促炎細(xì)胞因子的增加有關(guān)，且LXRβ缺失顯著影響福爾馬林誘導(dǎo)的外周組織炎癥的程度。
　　4.兩組小鼠右后足爪底射福爾馬林后，小鼠產(chǎn)生的典型的雙相疼痛反應(yīng)。LXRβ敲除小鼠平均疼痛評分與野生型小鼠

8、相比的各相傷害性反應(yīng)顯著增加。第一階段:WT，2.37±0.25; LXRβ敲除，3.28±0.09，p＜0.01;第2階段:WT，9.78±1.59; LXRβ敲除，13.95±2.51，p＜0.01）。分析了抬腳和舔舐時間，與野生型小鼠相比，LXRβ敲除小鼠顯著增加。（第一階段:WT，211.75±35.61秒;LXRβ敲除，372.75±20.41秒，p＜0.01;第2階段:WT，571.5±60.61秒;LXRβ敲除，1194.

9、6±161.89秒，p＜0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，LXRβ缺失引起在福爾馬林實(shí)驗(yàn)各個時相傷害性反應(yīng)顯著增強(qiáng)。
　　5.注射福爾馬林到小鼠的后足爪后，誘導(dǎo)脊髓注射一側(cè)Fos蛋白的大量表達(dá)。在野生型小鼠的脊髓L3-L5節(jié)段內(nèi)，大部分的Fos標(biāo)記的神經(jīng)元在脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)哟罅勘磉_(dá)，而的Ⅲ-Ⅴ層Fos蛋白標(biāo)記的神經(jīng)元的數(shù)目比在Ⅰ-Ⅱ?qū)语@著降低。與野生型小鼠相比，LXRβ敲除小鼠注射福爾馬林后，脊髓背角Ⅰ-Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ-Ⅴ層的Fos蛋白標(biāo)記的

10、神經(jīng)元的數(shù)目分別增加43％，135％分別和85％。這一增長提示福爾馬林注射后，足底注射誘導(dǎo)LXRβ敲除小鼠的脊髓背角更多傷害感受神經(jīng)元激活。
　　6.c-Fos與CaBPs的免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，LXRβ敲除小鼠與野生型小鼠相比，脊髓背角注射側(cè)Fos+/Calbindin+和Fos+/Calretinin+雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元百分比顯著增加。然而，脊髓背角Fos+/Parvalbumin+沒有雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元。因此，研究結(jié)果表明

11、LXRβ缺失引起小鼠足底注射福爾馬林后2小時，誘導(dǎo)脊髓背角淺層興奮性神經(jīng)元的激活。
　　7.IB4與SP或CGRP的免疫熒光雙標(biāo)共定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LXRβ敲除小鼠與野生型小鼠相比，小鼠接受注射福爾馬林足底注射后，脊髓L3-L5腰椎節(jié)段注射側(cè)背角淺層IB4，CGRP和SP的免疫陽性產(chǎn)物光密度值分別增加37％，47％，和47％。而脊髓L3-L5腰椎節(jié)段對照側(cè)背角淺層IB4，CGRP，或SP免疫陽性產(chǎn)物光密度值沒有顯著差異。因此，LXRβ

12、缺乏可促進(jìn)福爾馬林誘導(dǎo)的急性痛和炎癥痛初級傷害性傳入活化。
　　8.LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福爾馬林2小時后，脊髓背角淺層pERK免疫學(xué)陽性細(xì)胞與NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元進(jìn)行共定位后發(fā)現(xiàn)，pERK+陽性細(xì)胞與NeuN+陽性細(xì)胞有共標(biāo)，但不與GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞或Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞有共標(biāo)。同時Western blot檢測了脊髓L3-L5節(jié)段pERK的水平，結(jié)果顯示，LXRβ敲除小鼠脊髓pERK的水平較野生型小鼠顯

13、著增高。結(jié)果表明LXRβ的缺失可導(dǎo)致福爾馬林誘導(dǎo)小鼠脊髓背角神經(jīng)元pERK表達(dá)升高。
　　9.LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福爾馬后2小時后，脊髓背角注射側(cè)和對照側(cè)均出現(xiàn)明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)。與野生型小鼠相比，LXRβ敲除小鼠注射福爾馬林后2小時注射側(cè)脊髓背角淺層Ⅰ-Ⅴ層GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（野生型小鼠:131.4±9.83細(xì)胞個數(shù)/每張切片;LXRβ敲除小鼠，169.5±7.91細(xì)胞個數(shù)/每張切片;*p＜0

14、.05）。LXRβ敲除小鼠對照側(cè)脊髓背角GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)目與野生型小鼠的相比，顯著增高（野生型小鼠，106±1.5細(xì)胞個數(shù)/每張切片;LXRβ敲除小鼠，126.2±5.5細(xì)胞個數(shù)/每張切片;*p＜0.05）。
　　LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福爾馬后2小時后，Iba1標(biāo)記的免疫陽性細(xì)胞注射側(cè)數(shù)量顯著多于對照側(cè)，且主要集中于背角淺層Ⅰ-Ⅱ?qū)?。與野生型小鼠相比，髓背角Iba1陽性細(xì)胞在同側(cè)和對側(cè)腰脊的數(shù)量在LXRβ敲除小鼠

15、顯著增加（注射側(cè)，WT，111.8±3.5細(xì)胞個數(shù)/每張切片;LXRβ敲除，162.3±9.3細(xì)胞個數(shù)/每張切片;p＜0.01;對照側(cè)，WT，84.1±4.0細(xì)胞個數(shù)/每張切片;LXRβ敲除，106.1±3.5細(xì)胞個數(shù)/每張切片;p＜0.01）。結(jié)果表明，福爾馬林注射后，LXRβ缺乏激活小鼠的背角星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)炎性疼痛的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：
　　1.LXRβ在痛覺初級傳入終端及脊髓均有表達(dá)并發(fā)揮重要作用。<

16、br>　　2.LXRβ缺乏小鼠對有害熱刺激和炎癥性疼痛比野生型小鼠更敏感。
　　3.福爾馬林實(shí)驗(yàn)中，LXRβ敲除小鼠在兩個階段均增強(qiáng)疼痛反應(yīng)。這表明，LXRβ是外周和脊髓水平調(diào)制損傷誘導(dǎo)的痛覺過敏以及急性傷害性的關(guān)鍵因素之一。
　　4.LXRβ通過NF-κB途徑調(diào)節(jié)促炎性趨化因子如TNF-α和IL-1β的合成或釋放介導(dǎo)對福爾馬林的炎癥反應(yīng)。
　　5.LXRβ調(diào)節(jié)小鼠脊髓背角淺層興奮性神經(jīng)元活性，抑制傷害性刺激引起的痛覺