PI3-K-Akt通路介導野薔薇苷對抗急性缺氧性腦水腫及血管內(nèi)皮細胞損傷的機制研究.pdf

1、目的：本課題組前期研究表明，野薔薇苷（Rosamultin）是藏藥“蕨麻”中提取的活性單體成分，可以發(fā)揮抗氧化、抗缺血、耐缺氧損傷等多種藥理活性作用，能夠明顯減輕缺氧誘導的血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元細胞和心肌細胞損傷。但目前關于野薔薇苷的體內(nèi)抗缺氧活性及其抗缺氧分子調(diào)控機制未見報道。因此，本實驗在前期研究的基礎上，以清潔級SpragueDawley大鼠為研究對象，建立急性低壓缺氧損傷模型，觀察野薔薇苷對急性低壓缺氧誘發(fā)大鼠腦水腫的保護作用，并

2、初步探討其作用機制。由于急性缺氧性腦水腫與血管內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)密切相關，因此，本課題進一步通過體外血管內(nèi)皮細胞的缺氧損傷模型，深入分析野薔薇苷對PI3K/Akt信號通路的表達調(diào)控，從而探討野薔薇苷對抗急性缺氧性腦損傷的分子機制。
　　方法：研究內(nèi)容分為兩部分。
　　第一部分：野薔薇苷對急性低壓缺氧大鼠腦損傷的保護作用及對pAkt蛋白的表達調(diào)控
　　1、實驗分組：將50只成年雄性SD大鼠隨機分為5組：常氧對照組（C），

3、缺氧模型組（M），野薔薇苷高劑量組（H），野薔薇苷低劑量組（L），地塞米松組（N）。
　　2、急性低壓缺氧模型的建立：除常氧對照組外，其他各組均采用低壓氧艙建立大鼠急性低壓缺氧模型，模擬海拔7000m高原環(huán)境（溫度15±2℃，濕度30％±5%）缺氧18h。常氧對照組大鼠相同溫、濕度艙外正常飼養(yǎng)。
　　3、采用生化手段檢測各組大鼠腦海馬組織中LDH、SOD活性和MDA、GSH含量，以及血漿中NO含量。
　　4、采用干濕比

4、重法計算各組大鼠腦含水量，觀察各組大鼠腦水腫情況。
　　5、通過H.E染色法觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學變化。
　　6、應用免疫組織化學染色法，觀察各組大鼠腦組織中AQP1和AQP4表達變化情況。
　　7、利用免疫印跡技術（WesternBlot），觀察各組大鼠腦組織中pAkt蛋白表達變化情況。
　　第二部分：PI3-K/Akt通路介導野薔薇苷對抗急性缺氧誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷機制研究
　　1、實驗分組：取對數(shù)

5、生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細胞系EA.hy926細胞，隨機分為正常對照組（C）、PI3K抑制劑（LY294002）高、中、低濃度處理組（LY20、LY10、LY5）、缺氧模型組(M)、缺氧+LY294002高、中、低濃度處理組（M+LY20、M+LY10、M+LY5）、缺氧+野薔薇苷處理組（Y10）、缺氧+野薔薇苷+LY294002高、中、低濃度處理組（Y10+LY20、Y10+LY10、Y10+LY5）、缺氧+野薔薇苷+2-Methoxye

6、stradiol處理組（Y10+2-Me）。
　　2、急性缺氧損傷模型的建立：利用三氣培養(yǎng)箱建立急性缺氧損傷模型（5%CO2,95%N2,37℃），缺氧2h，正常對照組細胞同步培養(yǎng)于二氧化碳培養(yǎng)箱（5%CO2,37℃）。
　　3、通過MTT法觀察各組細胞代謝活力的變化；采用生化手段檢測各組細胞培養(yǎng)液中LDH外漏量以及各組細胞內(nèi)MDA、GSH含量和SOD、CAT活性。
　　4、通過臺盼藍排斥實驗檢測各組血管內(nèi)皮細胞的細胞

7、膜完整性和存活率。
　　5、運用Hochest/PI雙重染色和DAPI染色技術，觀察各組血管內(nèi)皮細胞凋亡形態(tài)學變化。
　　6、采用流式細胞術測定各組血管內(nèi)皮細胞凋亡率。
　　7、通過免疫熒光細胞染色法，觀察各組細胞中pAkt的表達情況，探討野薔薇苷對缺氧損傷血管內(nèi)皮細胞中Akt磷酸化水平的調(diào)控作用。
　　8、利用WesternBlot技術，觀察各組細胞中Akt,pAkt,HIF-1α,HIF-1β,Bax,Bcl

8、-2,CytC,Caspase-9,pro-Caspase-3,cleaved-Caspase-3等蛋白表達變化，探討野薔薇苷減輕缺氧誘導血管內(nèi)皮細胞損傷可能的分子機制。
　　結果：
　　第一部分：野薔薇苷對急性低壓缺氧大鼠腦損傷的保護作用及對pAkt蛋白的表達調(diào)控
　　1、與常氧對照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦海馬中LDH活性和MDA含量均顯著上升（P＜0.01），GSH含量、SOD活性和血漿中NO含量均顯著下降

9、（P＜0.01或P＜0.05）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高、低劑量組和地塞米松組大鼠腦海馬中LDH活性和MDA含量均顯著下降（P＜0.01），GSH含量、SOD活性和血漿中NO含量均顯著上升（P＜0.01或P＜0.05）。
　　2、與常氧對照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦含水量顯著增加（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高、低劑量組和地塞米松組大鼠腦含水量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　3、H.E

10、染色結果顯示：急性低壓缺氧模型組大鼠軟腦膜與腦皮質(zhì)明顯分離，間隙可見大量紅染細胞，腦皮質(zhì)中毛細血管周圍間隙變大，腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡或壞死；給予不同劑量野薔薇苷和地塞米松處理后均能明顯改善缺氧導致的大鼠腦組織病理學改變。
　　4、免疫組化結果顯示：與常氧對照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦組織中AQP1和AQP4陽性表達細胞數(shù)量均顯著增多（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高、低劑量組和地塞米松組大鼠腦組織中AQP1和

11、AQP4陽性表達細胞數(shù)量均顯著減少（P＜0.01）。
　　5、與常氧對照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦組織中pAkt表達水平顯著升高（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高劑量組大鼠腦組織中pAkt表達水平顯著升高（P＜0.01）。
　　第二部分：PI3-K/Akt通路介導野薔薇苷對抗急性缺氧誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷機制研究
　　1、MTT結果顯示：與缺氧模型組相比，LY294002高、中、低濃度組血管內(nèi)皮細胞代

12、謝活力均顯著降低（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷組血管內(nèi)皮細胞代謝活力顯著提高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組血管內(nèi)皮細胞代謝活力顯著降低（P＜0.01）。
　　2、酶學指標檢測結果顯示：與正常對照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中LDH外漏量及細胞內(nèi)MDA含量均顯著增多（P＜0.01），GSH含量及CAT、SOD活性均顯著降低（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷組血管

13、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中LDH外漏量及細胞內(nèi)MDA含量均顯著降低（P＜0.01），GSH含量及CAT、SOD活性均顯著升高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組細胞LDH外漏量及細胞內(nèi)MDA含量均顯著增多（P＜0.01或P＜0.05），GSH含量及CAT、SOD活性均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　3、臺盼藍染色結果顯示：與正常對照組相比，缺氧模型組藍染細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01）；與缺氧

14、模型組相比，野薔薇苷組藍染細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組藍染細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01）。
　　4、Hochest/PI雙染和DAPI染色結果顯示：野薔薇苷處理能夠明顯減少缺氧誘導的凋亡細胞數(shù)量增多，給予LY294002可抵消野薔薇苷的保護作用。
　　5、流式細胞術結果顯示：與正常對照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野

15、薔薇苷組細胞凋亡率顯著下降（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組細胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）。
　　6、免疫熒光染色結果顯示，正常組細胞中FITC標記的綠色熒光（pAkt）強度極其微弱，缺氧后熒光強度明顯增強，野薔薇苷處理后熒光強度進一步增強，但給予LY294002處理可明顯降低細胞內(nèi)綠色熒光強度。
　　7、Westernblot結果顯示：與正常對照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細胞中pAk

16、t、HIF-1α表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷組細胞中pAkt、HIF-1α表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組pAkt、HIF-1α表達水平均顯著降低（P＜0.01）。
　　8、Westernblot結果顯示：與正常對照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細胞中Bax、CytC、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表達水平均顯著升高（P＜

17、0.01），Bcl-2和pro-Caspase-3表達水平顯著降低（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷處理組血管內(nèi)皮細胞中Bax、CytC、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表達水平均顯著降低（P＜0.01），Bcl-2和pro-Baspase-3表達水平顯著升高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組及野薔薇苷和2-Me共處理組細胞中Bax、CytC、Caspase-9、cle

18、aved-Caspase-3表達水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2和pro-Caspase-3表達水平均顯著降低（P＜0.01）。
　　結論：
　　1、野薔薇苷可通過提高大鼠的抗氧自由基能力，對急性低壓缺氧誘導的大鼠腦損傷起保護作用。
　　2、野薔薇苷可通過抑制AQP1和AQP4的過表達，減輕急性低壓缺氧誘發(fā)的大鼠腦水腫。
　　3、野薔薇苷對抗急性低壓缺氧性腦損傷的作用可能與其上調(diào)pAkt的表達有關。