胰島素通過PI3K-Akt信號通路調控急性肺損傷ENaC介導的肺泡液體清除的機制研究.pdf

1、目的：通過建立非高血糖的急性肺損傷(ALI)動物模型，觀察胰島素對肺泡液體清除(AFC)和上皮鈉離子通道(ENaC)表達的調控，探討胰島素在ALI中的作用;同時通過體外培養(yǎng)肺泡上皮細胞A549，進一步明確在胰島素作用下調控ENaC可能的信號通路及作用機制，為其今后的臨床應用提供理論依據及新思路。
　　方法：
　　(1)成年健康的SD大鼠經腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，行頸靜脈置管。
　?、僖葝u素組(LPS+

2、Insulin):通過頸靜脈給予脂多糖(LPS)(5mg/kg)，在給予LPS前16h，微量泵入胰島素(0.1U/kg/h);
　?、阡茁嗝顾兀≒I3K阻斷劑）組(LPS+Insulin+Wortmannin):通過頸靜脈給予LPS（5mg/kg），在給予LPS前16h，微量泵入胰島素(0.1U/kg/h)，同時在給予LPS前90 min，LPS后90 min和360 min分別靜脈給予渥曼青霉素（0.06mg/kg）。

3、　?、壑嗵?LPS)組:通過頸靜脈給予LPS(5mg/kg)，在給予LPS前16h，微量泵入等量生理鹽水;
　?、軐φ战M（Control）:通過頸靜脈給予等量生理鹽水，并在頸靜脈注射前16h微量泵入等量生理鹽水。各組大鼠分別于頸靜脈注射后0、1h、4h、8h抽取靜脈血通過血糖儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血糖和胰島素含量變化。各組SD大鼠抽取靜脈血后處死，并收集完整肺組織。右肺行AFC和肺泡灌洗液(BALF)檢測，左肺行

4、總肺水含量(TLW)分析。采用HE染色觀察肺組織病理學改變，進行肺損傷評分比較。免疫組織化學檢測肺組織ENaC表達變化情況。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)測定肺組織ENaCmRNA及蛋白表達情況，Akt磷酸化水平和Nedd4-2蛋白表達情況。
　　(2)體外培養(yǎng)A549細胞
　　①對照組(Control):加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);
　?、谝葝u素組(Insulin):用含胰島

5、素(200 mU/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng);
　?、跮Y294002（PI3K阻斷劑）組(Insulin+LY294002):加入含LY294002(10μ M)的培養(yǎng)基培養(yǎng)30min，然后再加入相同作用濃度的胰島素;
　　④Akt抑制劑組(Insulin+Akt inhibitor):加入含Akt抑制劑(100 nM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)30min，然后再加入相同作用濃度的胰島素，各組均在加入胰島素后作用2h。RT-PCR和Western

6、 blot測定細胞ENaCmRNA及蛋白表達情況，Akt磷酸化水平和Nedd4-2蛋白表達情況，并進一步采用免疫共沉淀法檢測Nedd4-2蛋白與ENaC各亞基的變化關系。
　　結果：
　　(1)通過0、1h、4h、8h檢測血糖和胰島素含量發(fā)現(xiàn)各組血糖和胰島素變化無顯著差異。LPS組BALF中白介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，髓過氧化物酶(MPO)活性及蛋白含量與對照組比較顯著增加。胰島素作用后BALF中

7、IL-6，TNF-α，MPO活性及蛋白含量顯著減少，但胰島素引起的變化效應又被渥曼青霉素所阻斷。同時胰島素治療后顯著改善了LPS誘導的肺損傷病理變化，肺損傷病理評分顯著低于LPS組，但渥曼青霉素阻斷了胰島素作用的效應變化。與對照組比較，LPS組AFC顯著降低，TLW顯著增加。胰島素作用后AFC顯著增加，TLW顯著降低，而渥曼青霉素阻斷了胰島素的效應。與LPS組比較，給予胰島素顯著上調了α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRNA和

8、蛋白表達及Akt磷酸化水平，Nedd4-2蛋白表達下降。渥曼青霉素干預后，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRNA和蛋白表達及Akt磷酸化水平下降，Nedd4-2蛋白表達增加。
　　(2)胰島素作用細胞后明顯上調了α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRNA和蛋白表達，同時Akt磷酸化水平增加，Nedd4-2蛋白表達下降。分別給予LY294002和Akt抑制劑干預后，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRN

9、A和蛋白表達下降，Akt磷酸化水平下降，Nedd4-2蛋白表達增加。進一步通過免疫共沉淀檢測提示胰島素作用后與α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC結合的Nedd4-2表達減少。分別給予LY294002和Akt抑制劑干預后，與α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC結合的Nedd4-2表達增加。
　　結論；
　　(1)胰島素可以促進肺泡水腫液的清除，從而減輕ALI肺泡水腫液的聚集，降低肺水含量。
　　(2)胰島素通過