人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療阿爾茲海默癥細(xì)胞模型的作用及機(jī)制分析.pdf

1、阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種國際公認(rèn)的難治性神經(jīng)退行性疾病，并且是引起老年癡呆常見的病因。其主要病因尚無定論。就目前研究來看，其病因假說多達(dá)30多種，主要包括家族史、性別、腦外傷、教育水平低、甲狀腺相關(guān)疾病、生育年齡、病毒感染等。其主要的病理學(xué)變化是由 APP蛋白降解為Aβ并過度沉積引起的老年斑（SP），以及微管相關(guān)蛋白Tau過度磷酸化而引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）。其主要的臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力減退

2、、認(rèn)知功能障礙和記憶力的下降，這些癥狀都嚴(yán)重影響著患者及家屬的生活質(zhì)量。目前AD患者在世界范圍內(nèi)多達(dá)18，000，000人，隨著人們壽命的延長，這一數(shù)量將繼續(xù)增長。所以，加快AD的治療研究刻不容緩。雖然目前臨床上已有一些對癥治療的藥物，可以暫時(shí)緩解患者癥狀，但并不能完全控制病情的發(fā)展、改善患者認(rèn)知功能或改善預(yù)后。這不僅是目前AD及其治療方法研究的困擾，同時(shí)也是研究新型藥物或治療方法的有利契機(jī)。
　　就目前的研究看來，干細(xì)胞治療為多

3、種衰老相關(guān)的疾病帶來了福音。干細(xì)胞治療是一種先進(jìn)的醫(yī)學(xué)技術(shù)，這種技術(shù)是將健康的干細(xì)胞通過特異途徑移植到患者體內(nèi)，通過不同的作用機(jī)制，達(dá)到修復(fù)受損組織或替換受損細(xì)胞的目的。所以干細(xì)胞治療為一些疑難雜癥帶來了治療或治愈的希望。同時(shí)，干細(xì)胞本身來源廣泛，其移植治療的范圍也非常廣泛，已有研究證實(shí)其在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病和血液病等方面都有顯著的療效。干細(xì)胞由于其自我更新和多向分化的潛能，曾被醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“萬用細(xì)胞”，這就表示，其潛能還有待

4、進(jìn)一步開發(fā)，其作用還可以更加廣泛的應(yīng)用于疾病的治療中。
　　那么干細(xì)胞治療是否可以運(yùn)用于AD的治療呢？就目前的研究看來，這種治療方法是可行的，已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究證實(shí)，干細(xì)胞治療對包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有治療作用。目前針對AD的不同種類的干細(xì)胞治療主要包括：間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）,神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs），胚胎干細(xì)胞（ESCs），以及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSCs）。其中，NSCs，ESCs，iPSCs在動(dòng)物模型和

5、體外水平的研究中雖然發(fā)揮一定治療特性，但它們來源有限、不易分離獲得、體外擴(kuò)增受限、免疫排斥、倫理學(xué)受限等方面的缺陷使其很難開展進(jìn)一步的臨床研究，甚至使其進(jìn)入人體干細(xì)胞治療的理想遙遙無期。但是關(guān)于MSCs的研究很多，不僅有大量的文獻(xiàn)支持，而且已有臨床實(shí)驗(yàn)的開展。MSCs具有增殖能力強(qiáng)、易于分離獲得、多向分化、免疫原性低、免疫調(diào)節(jié)、旁分泌等特點(diǎn)，成為AD干細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。目前不同組織來源的MSCs均有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的開展，包括牙髓、臍血、

6、臍帶、脂肪、骨髓、胎盤等。這一現(xiàn)狀一方面肯定了MSCs對AD模型的治療效果，另一方面揭示了MSCs較其他種類的干細(xì)胞具有更多優(yōu)越性，包括來源廣泛、作用途徑和機(jī)制多樣等。就研究現(xiàn)狀來看，MSCs對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療機(jī)制研究包括免疫調(diào)節(jié)，多向分化，調(diào)節(jié)微環(huán)境等，這些機(jī)制都離不開其強(qiáng)大的分泌作用，這些功能也可能正好對癥于AD，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，甚至分化為神經(jīng)元等途徑發(fā)揮作用。
　　在不同組織來源的MSCs中，人臍帶華通

7、膠中分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）具有已經(jīng)被證實(shí)對神經(jīng)系統(tǒng)疾病有治療效果，其中包括AD. hUC-MSCs來源于產(chǎn)后廢棄組織，較其他來源的MSCs更易獲得，并且分離方法簡單，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，得率高，多向分化的能力也很強(qiáng)。這使其在眾多種類的MSCs中更具有優(yōu)越性。同時(shí)，在clinic trail網(wǎng)站上已經(jīng)有兩項(xiàng)關(guān)于hUC-MSCs治療AD的臨床實(shí)驗(yàn)的登記，更加說明這種干細(xì)胞治療的潛在優(yōu)勢和可行性。
　　但是，就目前的研究看

8、來，hUC-MSCs治療AD的機(jī)制問題尚無定論?；谄浔旧淼奶卣骱驮谄渌愋偷纳窠?jīng)系統(tǒng)疾病的研究機(jī)制，我們關(guān)注到了hUC-MSCs的分泌作用。因?yàn)閔UC-MSCs的免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)支持、促分化、促血管形成、調(diào)節(jié)微環(huán)境、促其他干細(xì)胞增殖分化等特點(diǎn)，都與其分泌因子息息相關(guān)。所以有人認(rèn)為這種治療作用主要由其分泌作用調(diào)節(jié)發(fā)揮。但是hUC-MSCs到底分泌了什么？在分泌譜中，又是那一種因子在AD中發(fā)揮關(guān)鍵的治療作用呢？這兩個(gè)問題是貫穿整個(gè)課題的核心

9、問題。
　　為了解答這兩個(gè)核心問題，我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：首先，我們利用岡田酸（OA）對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SH-SY5Y）進(jìn)行損傷，建立AD細(xì)胞模型，并在細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖和凋亡比例和蛋白水平對模型的穩(wěn)定性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證。之后用hUC-MSCs的條件培養(yǎng)基對模型進(jìn)行治療，同樣通過上述幾種方式對治療效果進(jìn)行驗(yàn)證。在肯定了hUC-MSCs的條件培養(yǎng)基對模型的治療效果之后，進(jìn)一步探討這種治療作用的機(jī)制。我們采用蛋白高通量篩選

10、的方法獲得了hUC-MSCs分泌因子的表達(dá)譜，再結(jié)合目前相關(guān)研究的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)其分泌的IL-6，HGF，ANG，sgp130等因子可能在修復(fù)AD模型中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步探討這些因子的介導(dǎo)作用，我們再次利用損傷模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HGF和 IL-6在hUC-MSCs分泌譜中作用關(guān)鍵，可能是介導(dǎo)AD細(xì)胞模型修復(fù)的關(guān)鍵因子。最后，為了進(jìn)一步明確HGF和IL-6的介導(dǎo)治療的作用，我們再次通過細(xì)胞水平、超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞活性等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)

11、果證實(shí)，HGF和IL-6在hUC-MSCs的分泌譜中高表達(dá)，并且介導(dǎo)了hUC-MSCs對AD的治療作用。
　　這一研究的意義在于：首先驗(yàn)證了hUC-MSCs對AD細(xì)胞模型的治療作用，并且這種治療作用是通過其分泌因子發(fā)揮的。其次，明確揭示了hUC-MSCs的分泌譜，并將其分泌因子進(jìn)行了定量分析。再次，驗(yàn)證了hUC-MSCs對AD細(xì)胞模型的治療作用是通過其分泌的HGF和IL-6介導(dǎo)的。
　　該部分研究在今后具有廣泛的應(yīng)用前景。就