電針調(diào)控下丘腦弓狀核SIRT1-FoxO1抑制攝食改善胰島素抵抗肥胖的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肥胖是引起胰島素抵抗的主要因素，而胰島素抵抗是肥胖導(dǎo)致2型糖尿病等代謝相關(guān)疾病的核心病理機(jī)制。對(duì)肥胖進(jìn)行早期干預(yù)，不僅能有效改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，而且可以防止其進(jìn)一步發(fā)展成為2型糖尿病，同時(shí)還對(duì)心腦血管事件的發(fā)生起到重要預(yù)防作用。下丘腦是機(jī)體食欲調(diào)節(jié)的中樞，弓狀核中的 POMC神經(jīng)元和 NPY神經(jīng)元通過(guò)釋放食欲肽，參與機(jī)體能量代謝。作為去乙?；?，下丘腦SIRT1對(duì)其底物FoxO1乙?；降恼{(diào)控與食欲肽有著緊密的聯(lián)系，

2、在能量平衡中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)以高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)觀察電針對(duì)胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦SIRT1及FoxO1乙酰化水平的影響，及FoxO1不同乙?；癄顟B(tài)下對(duì)下游食欲肽表達(dá)的作用，探討電針通過(guò)SIRT1/FoxO1信號(hào)通路對(duì)食欲的中樞調(diào)控及改善胰島素抵抗肥胖的相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用電針治療肥胖及胰島素抵抗相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　8周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠90只，隨機(jī)挑選15只大鼠

3、采用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。8周后，隨機(jī)挑選10只直接分入正常組。余下75只大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周，將造模成功的進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，并挑選50只隨機(jī)分入模型組、電針組、假手術(shù)組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組，每組10只。同時(shí)，8周后高脂誘導(dǎo)的IR肥胖大鼠每組各取3只行高胰島素—正葡萄糖鉗夾術(shù)以確定胰島素抵抗模型是否造模成功。分組完成后，將假手術(shù)組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組行第三腦室置管，術(shù)后恢復(fù)一周。電針組、電針加抑制劑組大鼠采用電針治療，取穴為中脘

4、、關(guān)元、足三里、豐隆。針刺后連接韓式電針儀，連續(xù)波，頻率2Hz，強(qiáng)度1mA，每周治療3次，足三里、豐隆兩穴左右交替使用，共治療8周。假手術(shù)組給予第三腦室注射人工腦脊液，電針加抑制劑組給予注射SIRT1特異性抑制劑EX-527，激動(dòng)劑組注射SIRT1特異性激動(dòng)劑SRT1720，接受腦室注射的時(shí)間與電針治療時(shí)間一致，正常組與模型組大鼠也在其它組進(jìn)行電針治療的同時(shí)進(jìn)行抓取固定。
　　分別在干預(yù)前、干預(yù)后2、4、6、8周測(cè)量所有大鼠的體重

5、、肛鼻長(zhǎng)、24小時(shí)進(jìn)食量、Lee’s指數(shù)、空腹及餐后血糖。在干預(yù)6周后檢測(cè)各組大鼠的腹腔糖耐量和胰島素耐量，每組取3只大鼠行高胰島素—正葡萄糖鉗夾術(shù)以檢測(cè)全身胰島素敏感性。各組大鼠處死前，心尖取血，檢測(cè)血清胰島素含量。大鼠處死后，取新鮮下丘腦組織，應(yīng)用Western Blotting法檢測(cè)下丘腦 SIRT1、FoxO1、Ac-FoxO1、POMC、NPY的蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)下丘腦SIRT1、FoxO1、Ac-FoxO1

6、、POMC、NPY的mRNA水平。大鼠灌注固定后取腦，行石蠟切片，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)SIRT1/FoxO1、SIRT1/Ac-FoxO1、FoxO1/POMC、Ac-FoxO1/NPY在下丘腦弓狀核中的蛋白定量及定位，并對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.電針對(duì)胰島素抵抗肥胖大鼠體重、進(jìn)食量、血糖、胰島素敏感性的影響。
　　所有大鼠體重在干預(yù)過(guò)程中仍呈上升趨勢(shì)。與正常組相比，高脂誘導(dǎo)的肥胖模型大鼠體重從

7、干預(yù)前到干預(yù)結(jié)束后均顯著升高（P＜0.05）；2周后，激動(dòng)劑組體重開始小于模型組（P＜0.05）；6周后，電針組體重開始小于模型組（P＜0.05）；8周后，電針組、激動(dòng)劑組、電針加抑制劑組大鼠體重均低于模型組（P＜0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），激動(dòng)劑組體重較低（P＜0.01）。假手術(shù)組體重在整個(gè)干預(yù)過(guò)程中與模型組均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與正常組相比，肥胖模型大鼠的 Lee’s指數(shù)在治療前及

8、整個(gè)治療過(guò)程中均顯著增高（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)8周干預(yù)，電針組與激動(dòng)劑組大鼠的 Lee’s指數(shù)均低于模型組（P＜0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組Lee’s指數(shù)較高（P＜0.05），而激動(dòng)劑組無(wú)差異（P＞0.05）。與正常組相比，模型組進(jìn)食量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組和激動(dòng)劑組進(jìn)食量明顯下降（P＜0.01）；與電針組相比，電針加抑制劑組進(jìn)食量較高（P＜0.05）， 激動(dòng)劑組進(jìn)食量較低（

9、P＜0.01）。
　　8周實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠各時(shí)間段的空腹血糖均無(wú)顯著性差異。經(jīng)過(guò)8周干預(yù)，與正常組相比，模型組餐后血糖顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組與激動(dòng)劑組餐后血糖均下降（P＜0.05），假手術(shù)組與模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組與激動(dòng)劑組血糖均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。正常組、電針組、電針加抑制劑組和激動(dòng)劑組大鼠的血清胰島素水平明顯低于模型組和假手術(shù)組（P＜0

10、.05），電針組胰島素水平低于電針加抑制劑組（P＜0.05），激動(dòng)劑組低于電針組（P＜0.05）。
　　在IPGTT試驗(yàn)中，所有大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下血糖無(wú)明顯差異。電針組和激動(dòng)劑組的餐后30min血糖上升幅度低于模型組和假手術(shù)組（P＜0.05），到120min后無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在 IPITT試驗(yàn)中，正常組、電針組、激動(dòng)劑組餐后30min血糖下降幅度明顯低于模型組和假手術(shù)組（P＜0.05），120min后正常組、電針組、激動(dòng)

11、劑餐后血糖仍明顯低于假手術(shù)組和模型組（P＜0.05）。
　　治療前（0周），與正常組相比，模型大鼠的GIR顯著降低（P＜0.01），高脂飼料喂養(yǎng)的各組大鼠GIR無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。干預(yù)6周后，正常組大鼠GIR無(wú)顯著變化，電針組和激動(dòng)劑組大鼠的GIR高于模型組和假手術(shù)組（P＜0.05），激動(dòng)劑組GIR高于電針組（P＜0.01）。
　　2.電針對(duì)胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦 SIRT1/FoxO1及下游食欲肽蛋白表達(dá)的影響

12、。
　　與正常組相比，胰島素抵抗肥胖大鼠模型下丘腦 SIRT1、FoxO1表達(dá)顯著減少。經(jīng)8周干預(yù)后，與模型組相比，激動(dòng)劑組下丘腦SIRT1的蛋白表達(dá)水平被上調(diào)到正常組水平，F(xiàn)oxO1水平亦顯著升高（P＜0.05）；電針組下丘腦SIRT1、FoxO1蛋白表達(dá)亦較模型組顯著增加（P＜0.05）；電針加抑制劑組SIRT1蛋白水平亦較模型組有顯著增加（P＜0.01），但低于電針組（P＜0.01），F(xiàn)oxO1水平較模型組升高不明顯（P＞0

13、.05），但低于電針組（P＜0.05）；假手術(shù)組SIRT1、FoxO1蛋白表達(dá)與模型組相比無(wú)顯著性變化；激動(dòng)劑組FoxO1高于模型組（P＜0.01），與電針組無(wú)差異（P＞0.05）。
　　各組 Ac-FoxO1的蛋白表達(dá)與 SIRT1相反，與正常組相比，模型組Ac-FoxO1表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）。與模型組相比，電針和激動(dòng)劑顯著降低胰島素抵抗肥胖大鼠 Ac-FoxO1蛋白表達(dá)水平，有非常顯著性差異（P＜0.01）；電針加

14、抑制劑組Ac-FoxO1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），但仍高于電針組（P＜0.01）；假手術(shù)組 Ac-FoxO1蛋白表達(dá)無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；激動(dòng)劑Ac-FoxO1低于電針組、高于正常組（P＜0.01）。
　　正常組下丘腦POMC蛋白含量最高，與正常組相比，模型組和假手術(shù)組POMC蛋白含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，激動(dòng)劑組、電針組、電針加抑制劑組下丘腦POMC蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），假手

15、術(shù)組無(wú)顯著性差異；與電針組相比，電針加抑制劑組POMC較低（P＜0.05），激動(dòng)劑組無(wú)差異（P＞0.05）。
　　與正常組比較，模型組NPY蛋白含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，激動(dòng)劑組NPY蛋白表達(dá)下降，具有非常顯著性差異（P＜0.01），電針組NPY蛋白表達(dá)較模型組亦減少（P＜0.05），電針加抑制劑組和假手術(shù)組較模型組無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與電針組相比，激動(dòng)劑NPY減少（P＜0.01），電針加抑制劑組無(wú)顯著

16、差異（P＞0.05）。
　　3.電針對(duì)胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦弓狀核 SIRT1/FoxO1及下游食欲肽共表達(dá)的影響。
　　SIRT1/FoxO1熒光雙標(biāo)結(jié)果提示，SIRT1與FoxO1細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。與正常組相比，模型組SIRT1和FoxO1表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組SIRT1和FoxO1表達(dá)升高（P＜0.05），假手術(shù)表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）；與電針組相比，電針加抑制

17、劑組SIRT1和 FoxO1表達(dá)下降(P＜0.05），激動(dòng)劑組無(wú)差異(P＞0.05）。SIRT1/Ac-FoxO1熒光雙標(biāo)結(jié)果示，SIRT1與Ac-FoxO1細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。與正常組相比，模型組和假手術(shù)組Ac-FoxO1在弓狀核表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組 Ac-FoxO1表達(dá)降低（P＜0.01），假手術(shù)表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組Ac-FoxO1較高（P＜0.0

18、1），激動(dòng)劑組較低（P＜0.01）。
　　FoxO1/POMC熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，各組FoxO1與POMC細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。與正常組相比，模型組POMC表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組POMC表達(dá)顯著上升（P＜0.01），假手術(shù)表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）；與電針組相比，針加抑和激動(dòng)劑組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Ac-FoxO1/NPY熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，各組Ac-FoxO1與NPY細(xì)胞

19、計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。與正常組相比，模型組NPY表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組NPY表達(dá)顯著下降（P＜0.01），假手術(shù)表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組較低（P＜0.05），激動(dòng)劑組無(wú)差異（P＞0.05）。
　　4.電針對(duì)胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦 SIRT1/FoxO1通路及下游食欲肽基因表達(dá)的影響
　　8周后，與正常相比，模型組SIRT1 mRNA水平顯著降低（

20、P＜0.01）；與模型組相比，電針組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；假手術(shù)組低于模型組（P＜0.05）；電針加抑制劑組低于假手術(shù)組（P＜0.05）；激動(dòng)劑組高于模型組（P＜0.01），與正常組無(wú)差異（P＞0.05）。與正常相比，模型組FoxO1 mRNA水平顯著亦降低（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、假手術(shù)組、激動(dòng)劑組無(wú)顯著差異（P＞0.05），電針加抑制劑組低于模型組（P＞0.05）。與正常組相比，模型組Ac-FoxO1 mRNA水

21、平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，電針組、假手術(shù)組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組均勻無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與正常組相比，模型組POMC mRNA水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組均上升（P＜0.05），假手術(shù)組無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組POMC mRNA下降（P＜0.01），激動(dòng)劑組上升（P＜0.05）。與正常相比，模型組NPY mRNA水平顯著上升（P

22、＜0.01）；與模型組相比，電針組、電針加抑制劑組、激動(dòng)劑組均下降（P＜0.05），假手術(shù)組無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與電針組相比，電針加抑制劑組和激動(dòng)劑組NPY mRNA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.電針干預(yù)8周后，高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖大鼠的體重增長(zhǎng)被抑制，進(jìn)食量減少，Lee’s指數(shù)下降，說(shuō)明電針能夠通過(guò)抑制攝食達(dá)到控制胰島抵抗肥胖大鼠體重增長(zhǎng)的目的。同時(shí)，胰島素抵抗肥胖大鼠的餐后血糖和血清胰島素水平在電針干預(yù)

23、后降低。此外，電針干預(yù)6周后，胰島素抵抗肥胖大鼠的腹腔糖耐量及腹腔胰島素耐量亦較模型組有明顯改善。葡萄糖鉗夾術(shù)結(jié)果顯示，電針組大鼠的葡萄糖輸注率顯著高于模型組。說(shuō)明電針在改善胰島素抵抗肥胖大鼠肥胖程度的同時(shí)還增加了其胰島素敏感性。在給予SIRT1抑制劑延第3腦室注射后，電針這種抑制體重增長(zhǎng)、減少進(jìn)食、增加胰島素敏感性的作用均被不同程度拮抗。單獨(dú)的應(yīng)用SIRT1激動(dòng)劑第3腦室注射也會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗肥胖大鼠出現(xiàn)體重增長(zhǎng)抑制、進(jìn)食減少和胰島素

24、敏感性增加的結(jié)果。說(shuō)明電針改善肥胖、增加胰島素敏感性的作用是通過(guò)特異性上調(diào)SIRT1實(shí)現(xiàn)的。
　　2.電針干預(yù)8周后，胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦弓狀核中SIRT1、FoxO1、POMC的蛋白表達(dá)被上調(diào)，Ac-FoxO1、NPY的蛋白表達(dá)被下調(diào)。電針干預(yù)聯(lián)合SIRT1抑制劑第3腦室注射后，SIRT1、FoxO1、POMC蛋白表達(dá)的上調(diào)被部分拮抗，Ac-FoxO1、NPY蛋白表達(dá)的下調(diào)亦被部分拮抗。單獨(dú)應(yīng)該用SIRT1激動(dòng)劑第3腦室注射

25、同樣出現(xiàn)SIRT1、FoxO1、POMC蛋白的上調(diào)和 Ac-FoxO1、NPY蛋白的下調(diào)。說(shuō)明電針能夠特異性的上調(diào)胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦弓狀核中SIRT1的蛋白表達(dá)，SIRT1的去乙酰化活性隨之增強(qiáng)，從而降低 FoxO1的蛋白乙?；?，導(dǎo)致下游抑食欲肽POMC的蛋白表達(dá)增加，促食欲肽NPY的蛋白表達(dá)降低，最終達(dá)到限制攝食、改善肥胖及胰島素抵抗的作用。
　　3.電針干預(yù)8周后，胰島素抵抗肥胖大鼠下丘腦中SIRT1、FoxO1、A

26、c-FoxO1的mRNA水平較模型組無(wú)顯著性差異，POMC的mRNA水平被上調(diào)， NPY的mRNA水平被下調(diào)。電針干預(yù)聯(lián)合SIRT1抑制劑第3腦室注射后， SIRT1、FoxO1的mRNA的水平被明顯下調(diào)，Ac-FoxO1與模型組無(wú)顯著差異，POMC mRNA水平的上調(diào)和NPY mRNA水平的下調(diào)均被部分拮抗。單獨(dú)應(yīng)用SIRT1激動(dòng)劑第3腦室注射后，SIRT1的mRNA水平被上調(diào)， FoxO1、Ac-FoxO1的mRNA水平與模型組與顯

27、著差異，POMC的mRNA水平被上調(diào)，NPY的mRNA水平被下調(diào)。結(jié)果表明，SIRT1抑制劑和激動(dòng)劑分別能夠下調(diào)和上調(diào)下丘腦中的SIRT1基因表達(dá)，而電針對(duì)SIRT1的基因表達(dá)水平無(wú)明顯影響。SIRT1去乙?；钚缘脑黾訉?duì) FoxO1及Ac-FoxO1的基因表達(dá)水平亦無(wú)明顯影響，而FoxO1的蛋白乙?；降牟煌軌蛘{(diào)控下游抑食欲肽POMC和促食欲肽NPY的基因表達(dá)。說(shuō)明電針調(diào)控食欲改善胰島素抵抗肥胖的作用靶點(diǎn)在 SIRT1的基因轉(zhuǎn)錄后