環(huán)形RNA形成機(jī)制及其作為退變性腰椎疾病合并骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)志物潛能研究.pdf

1、環(huán)形RNA是一類(lèi)新近被重新深入認(rèn)識(shí)的非編碼RNA分子。雖然，該類(lèi)分子早在幾十年前即被科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，但是多年以來(lái)，人們一直認(rèn)為它是RNA剪接(RNAsplicing)過(guò)程中產(chǎn)生錯(cuò)亂剪接而導(dǎo)致的產(chǎn)物，或由一些特異性病原體，如肝炎病毒、植物類(lèi)病毒等所產(chǎn)生。直到最近幾年，隨著分子生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，才有越來(lái)越多的證據(jù)表明，環(huán)形RNA分子是一個(gè)龐大的家族，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在各種真核生物的組織、細(xì)胞中有著廣泛的表達(dá)。
　　目前已知

2、環(huán)形RNA分為外顯子來(lái)源的環(huán)形RNA(circRNA)及內(nèi)含子來(lái)源的環(huán)形RNA(ciRNA)兩大類(lèi)。外顯子來(lái)源的環(huán)形RNA是由前體mRNA(precursormRNA)經(jīng)過(guò)反向剪接(back-splicing)產(chǎn)生的，其中有一小部分該類(lèi)環(huán)形RNA在剪接的過(guò)程中保留了部分內(nèi)含子序列(intron retention)，雖然大部分環(huán)形RNA的表達(dá)水平相對(duì)較低，但是也有一些表達(dá)量比其所在基因的線性RNA的還要高出10倍多。而內(nèi)含子來(lái)源的環(huán)形R

3、NA表達(dá)量相對(duì)較低，該類(lèi)環(huán)形RNA的產(chǎn)生源于內(nèi)含子剪接后產(chǎn)生的套索結(jié)構(gòu)(intron lariat)，其需要依賴(lài)特定的、保守的成環(huán)關(guān)鍵核酸序列，從而不被脫分支酶降解，是一類(lèi)從形成機(jī)制和概念上與外顯子來(lái)源環(huán)形RNA截然不同的一類(lèi)新分子。
　　但這兩類(lèi)環(huán)形RNA都有著重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。外顯子來(lái)源的環(huán)形RNA，如circRNA CDR1可以作為“分子海綿”，利用其上具有的microRNA的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行吸附，從而影響目的基因的表

4、達(dá)。已發(fā)現(xiàn)該類(lèi)分子還具有其他功能，如可以通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白作用等影響外顯子環(huán)化或影響線性基因的表達(dá)。而內(nèi)含子來(lái)源的環(huán)形RNA多定位在細(xì)胞核內(nèi)，并可通過(guò)與RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體相互作用，從而調(diào)控其所在基因的轉(zhuǎn)錄速度。
　　在本論文中，研究的主要對(duì)象是外顯子來(lái)源的環(huán)形RNA。已有研究表明，該類(lèi)分子與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。如阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化疾病、病理性心肌肥厚和心力衰竭、骨關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病。而環(huán)形RNA的存在并不是基因組轉(zhuǎn)錄過(guò)

5、程中的錯(cuò)誤，而是有其特有的機(jī)制。但其具體機(jī)制的研究尚存在空白。因此，本論文重點(diǎn)研究環(huán)形RNA形成的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上，在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面，進(jìn)一步探討其作為疾病診斷標(biāo)志物的潛能。
　　因此，我們首先通過(guò)體外分子生物學(xué)方法，成功的構(gòu)建環(huán)形RNA的體外表達(dá)載體，并研究了外顯子來(lái)源的環(huán)形RNA分子的一般特征。通過(guò)RNase R的富集作用，我們?cè)谌嗽磁咛ジ杉?xì)胞H9的RNA-seq數(shù)據(jù)中，利用環(huán)形RNA研究工具CIRCexplorer找到了一批高

6、可信度環(huán)形RNA，并選擇其中的代表成功進(jìn)行了體外驗(yàn)證。進(jìn)一步的，我們確定了POLR2A基因上第9、10兩個(gè)外顯子形成的環(huán)形RNA作為深入研究的對(duì)象，將這兩個(gè)外顯子序列和其兩側(cè)的內(nèi)含子序列構(gòu)建到pZW1載體上，形成circRNA POLR2A體外表達(dá)載體，并通過(guò)Sanger測(cè)序確認(rèn)了其構(gòu)建序列的正確性，由Northern Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其表達(dá)的有效性，這為進(jìn)一步深入其形成機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　在成功獲得環(huán)形RNA體外表達(dá)質(zhì)

7、粒后，本論文第二部分以HeLa-J細(xì)胞為工具，通過(guò)一系列分子生物學(xué)手段對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行了改造和系統(tǒng)研究。Alu元件(Alu elements)占整個(gè)基因組序列的11％，是一種長(zhǎng)約300bp的短重復(fù)序列，具有形成互補(bǔ)配對(duì)結(jié)構(gòu)的潛能。研究者認(rèn)為該互補(bǔ)序列對(duì)環(huán)形RNA的形成至關(guān)重要，因此進(jìn)一步在已構(gòu)建好的表達(dá)載體上對(duì)其內(nèi)含子上的Alu元件進(jìn)行了系統(tǒng)的缺失和替換突變。結(jié)果表明，互補(bǔ)序列是形成環(huán)形RNA的重要因素。綜上，研究者首次揭示反向互補(bǔ)序列導(dǎo)致

8、外顯子環(huán)化的重要機(jī)制，并在此基礎(chǔ)提出了“可變環(huán)化”的概念，以全新的理論角度更加深入的認(rèn)識(shí)了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性和多樣性。
　　在對(duì)該類(lèi)環(huán)形RNA分子的形成機(jī)制進(jìn)行了深入的研究后，研究者進(jìn)一步探索了環(huán)形RNA在臨床轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用的可能，即研究其作為退變性腰椎疾病合并骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)志物的潛能。研究者首先建立了血漿/血清外泌子RNA研究體系，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)及分子生物實(shí)驗(yàn)研究分析了其中環(huán)形RNA的表達(dá)和分布特點(diǎn)，結(jié)果顯示，在4℃和2

9、5℃條件下，環(huán)形RNA在血漿/血清中48h內(nèi)仍可以穩(wěn)定存在，血漿中環(huán)形RNA的種類(lèi)和表達(dá)量要明顯高于血清外泌子來(lái)源的環(huán)形RNA，加之為了進(jìn)一步減少血小板破裂釋放出RNA的影響，研究者進(jìn)一步選擇了受試者的血漿樣本作為后續(xù)研究的對(duì)象，通過(guò)已建立起的研究體系，篩選并鑒定了一組具有診斷生物標(biāo)志物潛能的環(huán)形RNA，為進(jìn)一步研究環(huán)形RNA與該疾病的關(guān)系打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)，為研究該疾病診治新的靶點(diǎn)提供了有力的支持。
　　綜上，本論文主要闡述了外顯

10、子來(lái)源環(huán)形RNA的形成機(jī)制，通過(guò)分子生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)方法，首次證實(shí)互補(bǔ)序列對(duì)外顯子環(huán)化的重要作用，并提出“可變環(huán)化”的概念，以全新的理論形態(tài)豐富了基因轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的多樣性和復(fù)雜性。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步建立了體外研究血液外泌子來(lái)源的環(huán)形RNA的研究體系，分析了在血漿/血清中環(huán)形RNA存在、表達(dá)和分布的特點(diǎn)，并通過(guò)更進(jìn)一步的分析研究，篩選了一組與退變性腰椎疾病合并骨質(zhì)疏松癥患者相關(guān)的環(huán)形RNA，證實(shí)其可作為該疾病潛在的診斷生物標(biāo)