Rab32及其相互作用蛋白的鑒定分析.pdf

1、樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是主要的一種抗原遞呈細胞，目前認為DC細胞抗原遞呈的方式有三種：一種是DC細胞吞噬外來抗原，并加工處理形成表位肽，與MHCⅡ類分子結合，從而激活CD4+T細胞；另外一種指DC細胞將內(nèi)源性合成的蛋白處理與MHCⅠ類分子結合激活CD8+T細胞；Bevan 提出了一種新的DC細胞遞呈抗原的方式——交叉遞呈（cross presentation），它是指抗原遞呈細胞將外源性的抗原加工處理，負載到

2、MHCⅠ類分子表面形成復合物，從而激活初始CD8+T細胞引起細胞免疫反應的過程。交叉遞呈對于監(jiān)視組織中的腫瘤以及清除那些不能感染抗原遞呈細胞的病毒起著十分重要的作用。詳細了解DC細胞交叉遞呈的機制將有助于我們更好的找到抗腫瘤和抗病毒的途徑，為腫瘤和病毒感染的免疫治療提供新的線索。但是目前對于DC細胞交叉遞呈的調(diào)節(jié)機制研究甚少在前面的研究中，我們下調(diào)了57種活化型Rab蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)包括Rab32在內(nèi)的12種Rab蛋白與抗原交叉遞呈有

3、關。目前,Rab32蛋白在抗原交叉遞呈中的作用機制研究未明。因此，為了了解Rab32在抗原交叉遞呈當中的工作機制，我們利用蛋白質組學的方法對Rab32及其相互作用蛋白進行鑒定分析。
　　 細胞內(nèi)的生理活動通常是通過多個蛋白間形成蛋白復合物而實現(xiàn)的，因此，要了解某種生理功能，就需要了解這種蛋白質與蛋白質之間的相互作用網(wǎng)絡。由于經(jīng)典的蛋白質組學研究方法—酵母雙雜交，只能夠研究兩兩蛋白質間的相互作用以及假陽性率過高，串聯(lián)親和純化結合質

4、譜技術的方法逐漸得到發(fā)展。
　　 目的：鑒定分析Rab32及其相互作用蛋白方法：1. Profinity eXact 標簽在真核生物系統(tǒng)當中的應用在對蛋白質的純化當中，親和標簽得到了廣泛的應用。相對于其他標簽而言，Profinity eXact 標簽作為一種新發(fā)明的標簽具有洗脫，結合通過同一標簽完成，不需要額外的步驟去除目的蛋白上的標簽殘留。由于利用該標簽純化后，在目的蛋白上沒有殘留，因此，所得到的目的蛋白更符合本身的生物特性。

5、但是，Profinity eXact 標簽在真核系統(tǒng)當中還沒有得到應用。
　　 因此，為了驗證Profinity eXact 標簽是否能夠在真核系統(tǒng)中很好的工作。我們構建了Profinity eXact 標簽融合表達EGFP的真核表達載體。利用磷酸鈣沉淀法，我們將真核表達載體轉染293FT細胞，使融合蛋白在293FT細胞中表達。然后，我們利用ProfinityeXact 標簽對融合蛋白進行了純化，并且利用熒光檢測和SDS-PAG

6、E 膠結合考染的方法對純化效果進行了驗證。
　　 2.鑒定分析Rab32及其相互作用蛋白為了鑒定Rab32的相互作用蛋白，我們構建了慢病毒載體FUEHTagEGFP、FUEHTagEYFPRab32。隨后，我們建立了穩(wěn)定表達的細胞系DC2.4FUEHTagEGFP、DC2.4TagEYFPRab32。在純化過程中，我們對構建的TAP 純化平臺的純化條件進行了優(yōu)化，構建了穩(wěn)定的TAP 純化平臺。隨后，我們利用TAP 技術對Rab3

7、2 進行純化，并且利用SDS-PAGE 結合銀染的方法對純化效果進行驗證。在獲得純化樣本后，我們對樣本進行了質譜分析，得到了可能是Rab32 相互作用蛋白的蛋白。串聯(lián)親和純化（TAP）
　　 包括兩次親和純化，每次純化所使用的純化標簽不一樣。相對于親和純化而言，串聯(lián)親和純化提高了樣本的特異性，降低了背景雜蛋白的含量。隨著質譜技術的發(fā)展，串聯(lián)親和純化結合質譜技術應用，能夠更好，更精準的檢測和鑒定分析蛋白質復合物。因此，我們選擇串聯(lián)

8、親和純化結合質譜技術的方法鑒定分析Rab32蛋白及其相互作用蛋白。
　　 結論：
　　 1）我們首先成功構建了Profinity eXact 標簽的真核表達載體。然后，我們將ProfinityeXact 標簽的真核表達載體通過磷酸鈣沉淀法轉染293FT細胞。我們觀察到，融合蛋白在293FT細胞中表達良好。在純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)純化蛋白主要通過第一次洗脫從親和層析柱上洗脫下來。隨后，我們進行SDS-PAGE 跑膠和考馬斯亮

9、藍染色，結果目的蛋白清晰可見。因此，我們認為Profinity eXact 標簽在真核系統(tǒng)當中工作良好，能夠獲得良好的純化效果。2）我們首先構建了串聯(lián)親和標簽EH-Tag的慢病毒表達載體FUEHTagEGFP、FUEHTagEYFPRab32。然后，我們建立了穩(wěn)定表達的細胞系DC2.4FUEHTagEGFP、DC2.4FUEHTagEYFPRab32。隨后，我們發(fā)現(xiàn)在第一次純化的過程中合適的洗滌次數(shù)為7次，0.01M NaN3是洗脫效率

10、最高的洗脫液。在純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過兩次結合，兩次洗脫后，我們得到的蛋白質量較少，因此，為了減少目的蛋白的損失，我們在第二次純化過程中只結合不洗脫。最后通過質譜分析，我們發(fā)現(xiàn)了4個與Rab32蛋白共同純化出來的蛋白，分別是Rab38、PHB、PHB2和MTA70我們得出結論：Profinity eXact 標簽在真核系統(tǒng)中能夠有效的工作。我們利用質譜對純化樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)了4個蛋白，其中Rab38、PHB、PHB2 可能是Rab3