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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
本文擬通過鈣化模型在細(xì)胞水平研究三碘甲腺原氨酸(3,5,3'-Triiodothyronine,T3)在血管鈣化及血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化時(shí)相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的變化和作用,并進(jìn)一步明確T3調(diào)節(jié)血管鈣化及VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的主要信導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而論證T3是抑制血管鈣化的重要內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì),為臨床調(diào)節(jié)和逆轉(zhuǎn)血管鈣化所致的動(dòng)脈高壓相關(guān)疾病提供有效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:
體
2、外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞A7r5,將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、鈣化模型組(加入β-甘油磷酸鹽和氯化鈣培養(yǎng)基)、T3干預(yù)組(在鈣磷培養(yǎng)基中加入T3,根據(jù)濃度再分為10-7、10-8、10-9mol/L三個(gè)亞組)和抑制劑干預(yù)組,對(duì)細(xì)胞采用茜素紅染色檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié),細(xì)胞骨鈣素含量測(cè)定,ALP活性檢測(cè),RT-PCR檢測(cè)Runx2和Osterix的mRNA含量,Western blot檢測(cè)骨化指標(biāo)OPN、SM22α-actin和SMα-actin
3、及信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表達(dá)水平,加入信號(hào)通路抑制劑后再次檢測(cè)Runx2和Osterix的mRNA含量以及OPN、SM22α-actin和SMα-actin的蛋白含量。
結(jié)果:
與正常對(duì)照組相比,鈣化組A7r5細(xì)胞的骨鈣素含量、ALP活性、Osterix和Runx2mRNA水平、OPN蛋白水平均顯著升高(P<0.01),SMα和SM22α蛋白水平顯著下降(P<0.01);加入T
4、3干預(yù)后細(xì)胞骨鈣素含量、ALP活性明顯降低,Osterix和Runx2mRNA、OPN蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而加入MMI后可阻斷以上T3的抑制效果;與鈣化組相比,抑制劑組Osterix和Runx2mRNA、OPN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。鈣化組可檢測(cè)到信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表達(dá)增加,加入整合素αvβ3/ERK阻斷劑(PD98059)、PI3K/Akt拮抗劑(LY294002)后,再用T3進(jìn)行干
5、預(yù),抑制鈣化的效果依然存在,但與單純加抑制劑組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,兩組間比較提示LY294002的抑制效果較PD98059明顯(P<0.01)。
結(jié)論:
1、鈣磷培養(yǎng)液誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞12天可成功構(gòu)建鈣化細(xì)胞模型。
2、T3可降低A7r5鈣化細(xì)胞的鈣沉積及堿性磷酸酶活性,此效應(yīng)呈濃度依賴性,說明T3是調(diào)節(jié)血管鈣化的內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)。
3、T3上調(diào)平滑肌細(xì)胞標(biāo)志分子SM22α和SMα,使骨相關(guān)蛋白OPN
6、的表達(dá)增加,同時(shí)檢測(cè)到骨分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的mRNA水平下降,而加入T3拮抗劑MMI后,上述T3抑制鈣化的效果被部分拮抗,說明T3通過抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)來調(diào)節(jié)血管鈣化。
4、鈣磷誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞鈣化過程中可檢測(cè)到信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、Akt的活化,加入相應(yīng)的抑制劑后表型轉(zhuǎn)化特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix和Runx2mRNA的表達(dá)均有所下調(diào),隨著抑制劑濃度的升高骨分化蛋白OPN
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