microRNA-31對(duì)HIV感染T細(xì)胞活化的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染人體后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞免疫損傷。T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)充分發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)作用的主要成分，也是HIV感染中最重要的效應(yīng)細(xì)胞，但是HIV感染使得T細(xì)胞免疫功能在感染早期就出現(xiàn)了功能障礙。與慢性免疫激活不同，T細(xì)胞的有效活化是T細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)一步發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)的基礎(chǔ)，對(duì)于HIV急性期/早期感染階段的有效活化受損研究較少且機(jī)制尚不明確。T細(xì)

2、胞的有效活化依賴于雙信號(hào)及細(xì)胞因子的共同作用，TCR與MHC復(fù)合結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合后，CD3將識(shí)別的抗原信息向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，啟動(dòng)細(xì)胞的活化過(guò)程，最終T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)。其中T細(xì)胞有效活化的信號(hào)傳導(dǎo)通路主要包括Ras-mapk(mitogen-activated protein kinase)通路、IP3-Ga(Inositol Trisphosphate-Calcium)通路及PKC（Protein kinase C）通路，

3、信號(hào)傳導(dǎo)的最終結(jié)果是活化了某些蛋白分子，被活化的蛋白質(zhì)在構(gòu)型上發(fā)生變化，使其具備了轉(zhuǎn)錄因子的功能。AP-1(Activator protein1)、NFAT(Nuclear factor of activated T-cells)、NF-κB(NuclearFactor kappa B)分別是三條信號(hào)通路活化的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)作用于某些特殊的基因，最終引起細(xì)胞功能的改變。CD69是T細(xì)胞最早期的活化標(biāo)志，在靜息淋巴細(xì)胞上不表達(dá)

4、，并且CD69可以很好的預(yù)測(cè)T細(xì)胞的增殖、分化、分泌等功能，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)T細(xì)胞有效活化能力的最快速、最常用、最典型的指標(biāo)。microRNA可以精確而有效地調(diào)控很多的生物進(jìn)程，同樣也參與了T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控，miR-155、miR-181c、miR-9均參與調(diào)控T細(xì)胞的活化反應(yīng)，miRNA是否參與HIV感染早期有效免疫活化不清楚。HIV感染會(huì)影響microRNA的表達(dá)譜發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)HIV快速進(jìn)展者感染早期miR-31明顯

5、低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-31可以上調(diào)CD4+T細(xì)胞表面CD69(Cluster of Differentiation69)的表達(dá)。本課題探究了miR-31與HIV感染有效活化反應(yīng)能力受損的關(guān)系以及miR-31對(duì)T細(xì)胞有效活化(CD69)的調(diào)控作用及作用機(jī)制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。研究結(jié)果顯示，HIV感染者T細(xì)胞有效活化反應(yīng)能力受損與感染者中miR-31的低表達(dá)有關(guān)，并且miR-31可以調(diào)控Ras-MAPK(mitogen-activated p

6、rotein kinase)信號(hào)通路促進(jìn)ERK1/2(Extracellular Signal-regulated Kinase-1/2)磷酸化來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞的有效活化。而Ras-MAPK信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子KSR2(Kinasesuppressors of Ras2)和DUSP7（Dual-specificity phosphatases7）同時(shí)作為miR-31的靶基因在該病理反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。我們的研究為明確HIV感染的免

7、疫受損及機(jī)制提供了新的信息。
　　方法：⑴miRNA過(guò)表達(dá)及敲減。PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells)及Jurkat細(xì)胞中miR-31的過(guò)表達(dá)應(yīng)用Amaxa電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒GFP-pMax-miR-31及對(duì)照組質(zhì)粒GFP-pMax-mock后置于37℃預(yù)溫的10％FBS(Fetal bovine serum)的1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后換液，培養(yǎng)至2

8、4h。293T細(xì)胞中miR-31的過(guò)表達(dá)應(yīng)用miR-31特異性mimics類似物以2nmol為轉(zhuǎn)染終濃度，通過(guò)HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至24h。PBMCs及23T細(xì)胞miR-31的敲減均采用miR-31特異性抑制劑antagomir，以500nmol為轉(zhuǎn)染終濃度，用不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基孵育2h，后添加3倍體積的含10％FBS的1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至72h(

9、PBMCs)或24h(23T細(xì)胞)。⑵T細(xì)胞活化的流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)。收取前期處理細(xì)胞，PBS（Phosphate buffer saline）洗兩遍離心，棄凈上清，用含10％FBS的1640培養(yǎng)基重懸，于包被anti-CD3/anti-CD28(0.5 ug/ml)的96孔板中刺激24h。避光染色(7AAD-Percp、CD3-PE-CY7、CD4-FITC/PE、CD8-APC、CD69-APC-CY7/PE)30min，離心洗滌細(xì)胞，

10、用BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀及BD FACSDiva TM軟件檢測(cè)并分析GFP+/CY3+的7-AAD-CD4+和7-AAD-CD8+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)水平。⑶總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄。收取前期處理細(xì)胞，采用RNeasy Plus Mini Kit試劑盒（細(xì)胞數(shù)大于1×106個(gè)/ml）或RNeasy Micro Kit試劑盒（細(xì)胞數(shù)小于1×106個(gè)/ml），按照試劑盒說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)方法提取細(xì)胞總RNA。將純化收集的總RNA立即用Primpsc

11、ript(@) RTreagent kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒說(shuō)明書要求，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20℃保存以便進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲減miR-31后靶基因的檢測(cè)。⑷miRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄。收取前期處理細(xì)胞，采用miRNeasy Mini Kit試劑盒（細(xì)胞數(shù)大于1×106個(gè)/ml）或miRNeasy Micro Kit試劑盒（細(xì)胞數(shù)小于1×106個(gè)/ml），按照試劑盒說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)方法提取細(xì)胞miRNA。將純化收集的miRNA立

12、即用Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒說(shuō)明書要求，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20℃保存以便進(jìn)行miR-31過(guò)表達(dá)或敲減水平的檢測(cè)。⑸熒光實(shí)時(shí)定量PCR。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣本，采用SYBR(@) Premix ExTaqTMⅡ試劑盒，定量體系參照試劑盒說(shuō)明書要求，按照試劑盒說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。GAPDH、U6分別作為總RNA定量和miRN

13、A定量的內(nèi)參。⑹胞內(nèi)蛋白磷酸化檢測(cè)。Jurkat細(xì)胞通過(guò)Amaxa電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)完成miR-31的過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)24h后，收取細(xì)胞PBS清洗，離心棄上清。細(xì)胞重懸，室溫避光染色(violet-Live-dead)30min后，PBS清洗，離心棄上清，細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸。將不同處理組分別置于96孔板中，anti-CD3&anti-CD28(2ug/ml)刺激15min、0min，加入等體積的預(yù)溫固定液，37度固定10min。收取細(xì)胞，4度洗液清

14、洗，離心棄上清。細(xì)胞重懸后，破膜劑冰上破膜30min，4度清洗，離心棄上清。避光4度染色(Alexa Fluor647-anti-ERK1/2，pT202/pY204)30min，4度清洗，離心棄上清后，細(xì)胞重懸，BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀及BD FACSDiva TM軟件檢測(cè)并分析Live-dead-Jurkat細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平。⑺統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相

15、關(guān)的兩組之間的比較用兩樣本的配對(duì)T檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①HIV感染者中miR-31低表達(dá)。結(jié)合前期miRNA-microarray的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，HIV感染者中miR-31的表達(dá)明顯減少(P=0.0018)。②miR-31調(diào)控T細(xì)胞的有效活化。鑒于miR-31的表達(dá)具有T細(xì)胞特異性，前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIV感染者中miR-31低表達(dá)且T細(xì)胞有效活化反應(yīng)能力受到損傷，我

16、們將進(jìn)一步探究miR-31對(duì)T細(xì)胞有效活化能力的調(diào)控作用。miR-31過(guò)表達(dá)上調(diào)T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)。健康人PBMCs電轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-31后，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miR-31過(guò)表達(dá)水平，同時(shí)TCR刺激24后，流式檢測(cè)GFP+CD4+T細(xì)胞及GFP+CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD4+T細(xì)胞中miR-31有效過(guò)表達(dá)后(P=0.0013)，CD4+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)明顯上調(diào)(P=0.0022)，CD8+T細(xì)胞

17、中miR-31有效過(guò)表達(dá)后(P=0.3494)，CD8+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)明顯上調(diào)(P=0.0170)。miR-31敲減下調(diào)T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)。健康人PBMCs用antagomir敲減miR-31后，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miR-31敲減后水平，同時(shí)TCR刺激24后，流式檢測(cè)CY3+CD4+T細(xì)胞及CY3+CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD4+T中miR-31有效敲減后(P=0.0084)，CD4+T細(xì)胞表面

18、CD69表達(dá)明顯下調(diào)(P=0.0020)，CD8+T中miR-31有效敲減后(P=0.0113)，CD8+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)明顯下調(diào)(P=0.0397)。③miR-31靶向調(diào)控靶基因KSR2和DUSP7。通過(guò)生物信息學(xué)方法，DAVID軟件進(jìn)行信號(hào)通路分析，最終確立了靶點(diǎn)評(píng)分較高且負(fù)調(diào)控T細(xì)胞活化的miR-31的靶基因RASA1、KSR2、PAQR3、DUSP7。通過(guò)在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-31，24h后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR

19、-31及靶基因mRNA水平，miR-31有效過(guò)表達(dá)10倍左右(P=0.0302)，靶基因KSR2、DUSP7mRNA水平明顯下調(diào)(P=0.0166，P=0.0439)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，靶基因RASA1、PAQR3 mRNA水平變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步在293T細(xì)胞中敲減miR-31，24h后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-31及靶基因mRNA水平，miR-31被有效敲減50％左右(P=0.0029)，靶基因KSR2、DUSP7 mRNA水

20、平明顯上調(diào)(P=0.0214，P=0.0296)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④miR-31調(diào)控Ras-MAPK信號(hào)通路促進(jìn)ERK1/2磷酸化。靶基因KSR2、DUSP7為Ras-MAPK信號(hào)通路中已知的負(fù)調(diào)控因子，我們將進(jìn)一步探究miR-31是否通過(guò)調(diào)控該通路影響ERK1/2磷酸化來(lái)促進(jìn)T細(xì)胞的有效活化。Jurkat細(xì)胞通過(guò)Amaxa電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)完成miR-31的過(guò)表達(dá)，TCR刺激15min后，流式檢測(cè)并分析ERK1/2磷酸化水平。結(jié)果顯示，mi