URI對(duì)骨髓瘤細(xì)胞調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是漿細(xì)胞來源的惡性腫瘤，好發(fā)于中老年人，傳統(tǒng)化療后中位生存期僅3~4年。據(jù)國外統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，MM的發(fā)病率已超過急性白血病，成為血液系統(tǒng)第二位常見的腫瘤。近十年來我科一直致力于MM的臨床和基礎(chǔ)研究，目前大劑量化療、造血干細(xì)胞移植及靶向治療藥物沙利度胺、來那度胺、硼替佐米的應(yīng)用雖然一定程度上提高了完全緩解率及總生存期，但幾乎所有MM患者最終都難逃疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展的厄運(yùn)，因

2、此急需尋找新的治療靶點(diǎn)。
　　至今URI在MM中作用還未見報(bào)道。我們首先比較URI在健康供者CD138+細(xì)胞、MM患者CD138+細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞株中的表達(dá)差異。接著利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定干擾URI的骨髓瘤細(xì)胞株，觀察URI干擾后對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡、藥物敏感性、小鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。最后研究URI對(duì)骨髓瘤作用機(jī)制的初步探討。
　　方法：
　　一、檢測(cè)URI在骨髓瘤細(xì)胞株及原代MM患者中的表達(dá)情況
　　Rea

3、l-time RT-PCR方法檢測(cè)5例健康供者漿細(xì)胞、12例MM患者骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株的URI mRN的表達(dá)情況。Western-blot方法分別檢測(cè)人骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266、ARH77、KM3的URI蛋白水平。用免疫組化方法比較10例脊柱外傷非腫瘤患者骨髓和22例骨髓瘤患者骨髓中URI蛋白的表達(dá)水平。
　　二、URI干擾后對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　1.構(gòu)建URI干

4、擾的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系
　　病毒LV-shURI和GFP-LVNC（對(duì)照）感染骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266，用嘌呤霉素篩選1~2w，Real-time RT-PCR、Western blot方法鑒定URI的表達(dá)水平。
　　2.URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞株增殖變化
　　CCK-8法檢測(cè)NCI-H929 NC/shURI、LP-1 NC/shURI、RPMI-8226 NC/shURI

5、、U266 NC/shURI細(xì)胞增殖情況并繪制生長曲線。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
　　3.URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞株克隆形成能力的變化
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-shURI和GFP-LVNC的NCI-H929、LP-1骨髓瘤細(xì)胞株，各取1×103細(xì)胞與甲基纖維素膠充分混勻后，接種于35 mm培養(yǎng)皿，觀察腫瘤克隆形成情況。
　　4.URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞小鼠體內(nèi)成瘤能力的變化
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-shURI和GFP-LVN

6、C的NCI-H929、LP-1骨髓瘤細(xì)胞株分別以2×107/側(cè)注射至6~8w齡NOD/SCID小鼠背側(cè)靠近后腿根部左右兩側(cè)皮下，定期測(cè)量皮下腫瘤大小。
　　三、初步探討URI在骨髓瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制
　　1.URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清中IL-6濃度的變化
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-URI和LVNC的NCI-H929、LP-1細(xì)胞以2×105/孔接種至12孔板，48h、72h后分別收集細(xì)胞取上清，ELISA方法檢測(cè)IL-6

7、濃度。
　　2.URI干擾后IL-6mRNA水平的變化
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-shURI和LVNC的NCI-H929、LP-1，用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)IL-6 mRNA水平。
　　3.URI干擾后IL-6啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的變化
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的LV-shURI和LVNC的NCI-H929、LP-1細(xì)胞接種于48孔板，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑瞬轉(zhuǎn)IL-6熒光素報(bào)告質(zhì)粒(0

8、.2μg/孔)及內(nèi)參pRL-TK報(bào)告質(zhì)粒(0.02μg/孔)，24h后用IP裂解液裂解，用報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)值。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)采用用GraphPad Prism4和SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以X±SD表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有非常顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　一、URI在MM患者中表達(dá)明顯上調(diào)
　　1

9、.Real-time RT-PCR方法檢測(cè)5例健康供者和12例MM患者URI基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MM患者CD138+細(xì)胞URI mRNA水平顯著高于健康供者CD138+細(xì)胞（P<0.05）。Real-time RT-PCR方法檢測(cè)NCI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266、ARH77細(xì)胞URI基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示絕大多數(shù)骨髓瘤細(xì)胞株URI mRNA水平高于健康供者。
　　2.Western blot方法檢測(cè)人骨

10、髓瘤細(xì)胞株NCI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266、ARH77、KM3和KMS11中URI水平，結(jié)果7株細(xì)胞中均能檢測(cè)到URI蛋白。
　　3.用免疫組化方法比較10例脊柱外傷非腫瘤患者骨髓和22例骨髓瘤患者骨髓中URI蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果按照德國IRS評(píng)分，22例骨髓瘤患者骨髓中20例URI表達(dá)較高，而10例脊柱外傷患者的骨髓中僅2例URI表達(dá)較高。
　　二、成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾URI的骨髓瘤細(xì)胞株
　　N

11、CI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266細(xì)胞株感染LV-shURI及GFP-LVNC48h，并且嘌呤霉素篩選1~2w后，分別用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)顯示NCI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266感染LV-shURI后URI mRNA和蛋白水平顯著均低于感染LVNC組，提示成功構(gòu)建URI干擾骨髓瘤細(xì)胞系。
　　三、URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞株增殖、克隆形成能力及NO

12、D/SCDI小鼠皮下荷瘤能力受抑制
　　1.URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞體外增殖減慢
　　穩(wěn)定感染LV-shURI和LVNC的骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929、LP-1、RPMI-8226、U266用CCK-8法檢細(xì)胞增殖，結(jié)果與對(duì)照細(xì)胞相比，URI干擾后的細(xì)胞增殖明顯減慢。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，URI干擾后NCI-H929、U266細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例明顯減少，而S期細(xì)胞比例增加，提示細(xì)胞阻斷在S期。
　　2.URI后骨

13、髓瘤細(xì)胞克隆形成能力下降
　　穩(wěn)定感染的NCI-H929 shURI/NC、LP-1 shURI/NC細(xì)胞系，接種于甲基纖維素培養(yǎng)基中，結(jié)果10天后克隆明顯形成，URI干擾細(xì)胞細(xì)胞系克隆數(shù)目顯著少于對(duì)照細(xì)胞系（P<0.05）。
　　四、URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞株中干性細(xì)胞減少
　?。?）URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞株SP細(xì)胞比例下調(diào)
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-shURI后，NCI-H929 SP細(xì)胞比例從3.13％降至0，LP-

14、1 SP細(xì)胞比例從0.24%降至0.07%。Real-time RT-PCR方法檢測(cè)顯示，干擾URI后，NCI-H929和LP-1細(xì)胞中ABCG2 mRNA水平均顯著下調(diào)。
　?。?）2URI干擾后干性基因mRNA表達(dá)下調(diào)
　　Real-time RT-PCR檢測(cè)LP-1、NCI-H929細(xì)胞株shURI細(xì)胞株SOX2、OCT4、BMI-1、NOTCH、c-Myc、KLF4mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與NC細(xì)胞相比shURI

15、細(xì)胞株上述干性基因顯著下調(diào)。
　　五、URI干擾后骨髓瘤細(xì)胞對(duì)硼替佐米敏感性增加
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-shURI后的NCI-H929、LP-1骨髓瘤細(xì)胞株，0~40nM濃度梯度硼替佐米作用48h后，CCK-8法檢測(cè)顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞活力顯著下降（P<0.05）。
　　六、URI干擾后IL-6表達(dá)下調(diào)、STAT3活性減低
　　1.URI干擾后細(xì)胞上清中IL-6水平下調(diào)
　　ELISA方法檢測(cè)LP-1

16、 NC/shURI、NCI-H929 NC/shURI細(xì)胞上清中IL-6水平，結(jié)果顯示培養(yǎng)48h和72h后shURI細(xì)胞株上清中IL-6水平顯著低于NC細(xì)胞株。
　　2.URI干擾后IL-6 mRNA表達(dá)下調(diào)
　　Real-time RT-PCR方法檢測(cè)NC/shURI細(xì)胞IL-6 mRNA水平顯示，結(jié)果顯示LP-1 shURI細(xì)胞IL-6 mRNA水平顯著低于LP-1 NC細(xì)胞（P<0.01）；NCI-H929 shURI

17、細(xì)胞IL-6 mRNA水平顯著低于LP-1 NC細(xì)胞（P<0.05）。
　　3.URI干擾后IL-6報(bào)告基因表達(dá)下調(diào)
　　熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顯示，與LP-1NC細(xì)胞相比，LP-1shURI細(xì)胞IL-6報(bào)告基因表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），與NCI-H929 NC細(xì)胞相比，NCI-H929 shURI細(xì)胞IL-6報(bào)告基因表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.與健康供者相比，大部分人骨髓瘤細(xì)