一種嗜鹽古生菌胞外蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)特性研究.pdf

1、嗜鹽古生菌是一類極端嗜鹽菌，一般在15-20％的鹽濃度下生存，因此其所產(chǎn)的胞外蛋白酶也可能在極端環(huán)境下保持穩(wěn)定的活性，有著在高鹽、堿性以及高溫等嚴(yán)峻環(huán)境中應(yīng)用的潛力。本課題從已鑒定的幾株嗜鹽古生菌中篩選出一株產(chǎn)胞外蛋白酶能力較高的Halogranum rubrum RO2-11，對其胞外蛋白酶進(jìn)行分離純化，并研究了蛋白酶生物學(xué)特性和其水解肌肉蛋白的性質(zhì)，為尋求一種新型食品工業(yè)用耐鹽蛋白酶提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　

2、1.產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古生菌的篩選及粗蛋白酶性質(zhì)研究。選取五株嗜鹽古生菌Halalkalicoccus tibetensis TBN4、Halogranum rubrum TNN48、Halogranumrubrum RO2-11、Halomicrobiummukohataei9738、Haloplanus aerogenes TBN37,接種于脫脂奶粉平板中，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后測定各平板中水解透明圈直徑的大小，其中透明圈直徑最大的為

3、Halogranum rubrum RO2-11，說明Halogranumrubrum RO2-11在同樣培養(yǎng)條件下產(chǎn)胞外蛋白酶的能力最強。選用Halogranumrubrum RO2-11對其胞外蛋白酶粗酶特性進(jìn)行初步研究，研究結(jié)果表明該蛋白酶可以耐受高濃度的NaC1，表現(xiàn)出耐鹽特性;蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為8.0，并在pH8.0到pH11.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定，表明該酶是一種堿性蛋白酶;Ca2+對該蛋白酶的酶活性表現(xiàn)出

4、促進(jìn)的作用，金屬離子Mn2+和Cu2+則對該蛋白酶有抑制作用;金屬螯合劑EDTA可強烈地抑制蛋白酶活性，表明該蛋白酶可能是一種金屬蛋白酶，絲氨酸抑制劑PMSF和巰基反應(yīng)物DTNB則對該蛋白酶的活性影響很小;蛋白酶活性受有機溶劑異丙醇的影響也很小，表明該蛋白酶可耐受一定濃度的有機溶劑。
　　2.采用超濾濃縮、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sepadex G-100凝膠層析三步對嗜鹽古生菌Halogra

5、num rubrum RO2-11所產(chǎn)的胞外蛋白酶進(jìn)行分離純化，經(jīng)純化后的蛋白酶比活力達(dá)到8226.64 U/mg，回收率為19％，純化倍數(shù)為32.4倍，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳和非變性凝膠電泳后確定該蛋白酶分子量為47 kDa。該蛋白酶在高濃度的鹽環(huán)境下性質(zhì)穩(wěn)定，其最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為8.0且在pH7.0到pH10.0的偏堿性環(huán)境下穩(wěn)定。EDTA對蛋白酶的活性有明顯的抑制作用表明此酶是一種金屬蛋白酶，在一定濃

6、度的二甲基亞砜、甲醇、乙醇和異丙醇等有機溶劑的存在下，蛋白酶的活力保持穩(wěn)定，在表面活性劑方面，蛋白酶活力在0.1％ Triton X-100條件下較為穩(wěn)定但卻受到SDS的抑制。此外，Ca2+對蛋白酶具有激活作用。根據(jù)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MASCOT-TOF/TOF MS)的結(jié)果可以推測此蛋白酶與Halogranum salarium所產(chǎn)的蛋白酶有相似的性質(zhì)。
　　3.Halogranum rubrum RO2-1

7、1胞外蛋白酶水解肌肉蛋白特性及產(chǎn)物分析。提取鰱魚肌球蛋白，將嗜鹽古生菌Halogranum rubrum RO2-11胞外蛋白酶作用于所提取的肌球蛋白，十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳分析其水解情況，甲醛滴定法測定蛋白質(zhì)水解度，凝膠滲透色譜測定水解產(chǎn)物的分子量分布，氨基酸分析儀測定肌球蛋白水解液中游離氨基酸含量。試驗結(jié)果表明該蛋白酶對鰱魚肌球蛋白有著較好的水解能力，水解后氨基酸態(tài)氮含量為1076μg/mL;經(jīng)凝膠滲透色譜分析水解產(chǎn)物的分