梓醇調(diào)控m-TOR信號促進坐骨神經(jīng)損傷修復作用及機制研究.pdf

1、背景：梓醇是地黃的主要有效成分之一，既往研究表明，梓醇能夠促進原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長，能夠改善腦缺血大鼠軸突、樹突再生和重構。但是梓醇對外周神經(jīng)損傷是否具有修復作用尚不清楚?；谕庵苌窠?jīng)損傷尤其是坐骨神經(jīng)損傷的高發(fā)率，以及治療效果不理想的現(xiàn)狀，研究梓醇對坐骨神經(jīng)損傷的作用和機制，有助于為臨床提供治療的新手段，具有重要的科學價值和臨床意義。本課題目的在于：
　　1.觀察坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)行為學變化以及梓醇對其行為學的影響；

2、
　　2.觀察梓醇對小鼠坐骨神經(jīng)損傷后L4-L6脊髓-坐骨神經(jīng)-神經(jīng)肌接頭-腓腸肌構成的運動神經(jīng)單元結構和功能的影響；
　　3.研究梓醇對坐骨神經(jīng)損傷的保護和修復作用是否與調(diào)控m-TOR信號通路有關；以期為坐骨神經(jīng)損傷治療提供新的治療藥物。
　　第一部分、梓醇促進坐骨神經(jīng)損傷功能修復作用的評價
　　目的：觀察坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)行為學變化以及梓醇對其行為學的影響。
　　方法：
　　1.采用鉗夾法制備小鼠

3、坐骨神經(jīng)損傷模型，術后分為梓醇組（10mg/kg）、模型組和假手術組(生理鹽水)腹腔注射給藥，每天一次，連續(xù)7天；
　　2.采用熱板法和墨汁印記法檢測小鼠術后1、4、7天感覺和運動的變化及梓醇對其行為學的改變，評價梓醇對神經(jīng)損傷后功能的恢復情況；
　　3.術后7天，取雙側腓腸肌，計算腓腸肌濕重比，并進行HE染色觀察肌細胞的形態(tài)學，測定肌纖維橫截面積，觀察梓醇改善腓腸肌萎縮的程度；
　　4.術后7天，尾靜脈注射熒光染料E

4、vans Blue，觀察梓醇對血-神經(jīng)屏障的修復作用。
　　結果：
　　1.梓醇顯著改善坐骨神經(jīng)損傷后小鼠的感覺和運動功能的恢復
　?。?）梓醇顯著提高了痛閾值：梓醇治療后第4、7天（27.06s±2.17、34.48s±3.72）痛閾值相比相應時點模型組（12.13s±2.82、12.91s±4.15)顯著延長(P＜0.05，P＜0.01)；
　?。?）梓醇顯著改善了坐骨神經(jīng)功能指數(shù)：梓醇治療后第4、7天（-8

5、2.52±2.12、-70.12±1.90）的SFI值均顯著高于模型組（-91.88±2.63、-88.32±4.19，P＜0.05）；2.梓醇有效阻止了坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌萎縮的程度
　?。?）與模型組（0.586μm2±0.046）比較，梓醇顯著提高腓腸肌濕重比（0.825μm2±0.039，P＜0.05）；
　?。?）梓醇顯著增加肌纖維橫截面積（774.67μm2±65.07），與模型組（452.10μm2±50.41

6、）相比具有顯著性差異（P＜0.05)；
　?。?）腓腸肌HE染色顯示模型組肌細胞直徑明顯減小，肌細胞空泡樣形態(tài)，肌纖維間隙變大，肌纖維溶解；梓醇組肌細胞直徑較均勻，排列整齊，胞核清晰且數(shù)目較多；
　　3.梓醇減輕血神經(jīng)屏障滲漏
　　EB染色結果顯示，模型組熒光信號在神經(jīng)內(nèi)膜較強，清晰可見EB從微血管腔滲漏至神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜；梓醇治療后，紅色熒光信號在神經(jīng)內(nèi)膜明顯減弱。
　　結論：梓醇可促進坐骨神經(jīng)損傷后修復及功

7、能的恢復，減少血神經(jīng)屏障的滲漏。
　　第二部分、梓醇對小鼠坐骨神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)單元結構的影響
　　目的：觀察梓醇對小鼠坐骨神經(jīng)損傷后L4-L6脊髓—坐骨神經(jīng)—神經(jīng)肌接頭—腓腸肌構成的運動神經(jīng)單元結構的影響
　　方法：
　　1.采用鉗夾法制備小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，術后分為5組：梓醇組(10mg/kg)，雷帕霉素組(0.5mg/kg)，雷帕霉素+梓醇組(0.5mg/kg+10mg/kg),模型組和假手術組(生理鹽水

8、)腹腔注射給藥，每天一次，連續(xù)7天；
　　2.采用尼氏和TUNEL染色觀察脊髓L4-L6的存活率及凋亡率，Western blot檢測脊髓Bax和Bcl-2的蛋白表達情況；
　　3.采用透射電鏡，觀察坐骨神經(jīng)的超微結構并測量神經(jīng)纖維髓鞘厚度，檢測髓鞘再生的情況；
　　4.制作冰凍切片，采用乙酰膽堿酯酶和氯化金壓片法觀察梓醇對腓腸肌中神經(jīng)肌接頭(運動終板)以及神經(jīng)末梢的影響。
　　結果：
　　1.梓醇抑制L4

9、-L6脊髓神經(jīng)元的凋亡，促進神經(jīng)元的存活
　　（1）尼氏染色顯示假手術組感覺和運動神經(jīng)元形態(tài)正常，有較多的胞體突起，尼氏體大而多，呈虎斑樣；模型組感覺和運動神經(jīng)元皺縮，大型神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細胞碎裂呈現(xiàn)泥沙樣；梓醇組感覺和運動神經(jīng)元細胞胞體較大，軸突清晰可見，大型神經(jīng)元數(shù)目顯著高于模型組且染色較模型組深，提示細胞合成功能旺盛；雷帕+梓醇組感覺和運動神經(jīng)元形態(tài)較為完整；雷帕霉素組感覺和運動神經(jīng)元尼氏體顏色變淺，大型神經(jīng)元數(shù)目減少；

10、
　　（2）梓醇抗神經(jīng)元凋亡模型組（54.28±10.71）凋亡細胞數(shù)量與假手術組（9.71±2.09）相比顯著性增加（P＜0.01），提示造模成功；梓醇（16.39±2.64）治療后與模型組相比能顯著抑制凋亡（P＜0.05）；Western blot結果顯示模型組Bax蛋白表達顯著高于假手術組（P＜0.05），梓醇組蛋白表達與模型組相比明顯降低(P＜0.05)；模型組Bcl-2蛋白表達量明顯低于假手術組（P＜0.05)；與模型組

11、相比，梓醇組Bcl-2蛋白表達明顯升高（P＜0.05)；經(jīng)統(tǒng)計學分析，梓醇顯著上調(diào)Bcl-2與Bax的比值。
　　2.梓醇促進坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘修復
　　坐骨神經(jīng)損傷后，模型組髓鞘模糊，板層結構松解，部分空泡化，排列稀疏；假手術組髓鞘呈圓形或橢圓形排列且整齊有序，板層結構較緊密；梓醇組髓鞘呈類圓形或卵圓形，板層排列致密、較厚，無脫髓鞘改變；雷帕+梓醇組軸突基本恢復，髓鞘板層結構變得清晰，較致密，脫髓鞘現(xiàn)象已不明顯；雷帕霉素組

12、神經(jīng)纖維髓鞘形狀不規(guī)則，出現(xiàn)脫髓鞘化，空網(wǎng)狀結構，板層厚度較薄；定量分析顯示模型組再生有髓神經(jīng)纖維的厚度（0.1117μm±0.0351）與假手術組再生有髓神經(jīng)纖維的髓鞘厚度（0.1608μm±0.0571）相比具有顯著性差異(P＜0.05)；梓醇組髓鞘（0.1552μm±0.0710）、雷帕+梓醇組（0.1385μm±0.0399）髓鞘與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05)；雷帕組因髓鞘空泡嚴重，完整的髓鞘不夠統(tǒng)計數(shù)量，因此未統(tǒng)計

13、。
　　3.梓醇延緩坐骨神經(jīng)損傷后骨骼肌神經(jīng)肌接頭或運動終板的退變
　　（1）坐骨神經(jīng)損傷后，假手術組運動終板體積較大，邊緣光滑，染色深，呈類圓形，結構清晰；模型組運動終板退化萎縮，形態(tài)不規(guī)則，邊緣毛糙,運動終板數(shù)量減少；梓醇治療后運動終板呈圓形，結構清晰，數(shù)量增多；雷帕組運動終板花紋消失，結構紊亂,褪變嚴重；定量分析顯示模型組(5.7±2.19）和雷帕霉素組（5.1±1.37）腓腸肌中運動終板數(shù)量相比假手術組（16.3±1

14、.92）有顯著性的減少(P＜0.01)；梓醇（12.8±3.06）與模型組相比運動終板的數(shù)量明顯增多(P＜0.05)；梓醇聯(lián)合雷帕霉素治療（9.3±2.57）后，能夠部分逆轉雷帕霉素所致的改變。
　?。?）氯化金染色顯示模型組肌纖維紊亂，軸索末梢不規(guī)則；假手術組軸索末梢呈樹狀樣；梓醇組軸索末梢呈樹干樣相互連接，形成網(wǎng)絡延肌纖維分布清晰；雷帕+梓醇組與雷帕組相比肌纖維分布清晰，終末分支增加。
　　結論：梓醇抗神經(jīng)元凋亡，促進神

15、經(jīng)元的存活，阻止周圍神經(jīng)受損后脊髓神經(jīng)元的減少；能降低受損神經(jīng)的脫髓鞘程度，有效促進受損坐骨神經(jīng)的再生，延緩運動終板的退變，可能與m-TOR信號有關。
　　第三部分、梓醇激活m-TOR信號通路對小鼠坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生的影響
　　目的：研究梓醇對坐骨神經(jīng)損傷的保護和修復作用是否與調(diào)控mTOR信號通路有關
　　方法：
　　1.模型制備和分組同第二部分；
　　2.行為學檢測方法同第一部分，評價梓醇改善雷帕霉素

16、所致的行為學的影響；
　　3.Western blot方法檢測各組織中m-TOR信號通路Akt、p-Akt、m-TOR、p-m-TOR、P70S6K、p-P70S6K、PTEN and p-PTEN的蛋白表達；
　　4.制作冰凍切片，采用免疫熒光組織化學標記方法觀測GAP-43在脊髓和坐骨神經(jīng)軸突的表達情況；Western blot半定量分析GAP-43和BDNF蛋白在脊髓的表達。
　　結果
　　1.梓醇改善雷帕

17、霉素所致的行為學功能變化
　?。?）梓醇顯著提高了痛閾值：梓醇組、梓醇聯(lián)合雷帕組（27.06s±2.17、32.51s±1.88）治療后第4天熱板反射時間延長，耐痛閾提高，與雷帕組（12.70s±3.79）相比有差異（p＜0.05），梓醇組、梓醇聯(lián)合雷帕（34.48s±3.72、27.06s±4.24）治療后第7天熱板反射明顯時間延長，痛閾提高較雷帕組（14.17s±3.05）有顯著性差異（p＜0.01)。
　?。?）梓醇顯

18、著改善了坐骨神經(jīng)功能指數(shù)：術后第4天，梓醇組（-82.52±2.12）顯著高于雷帕組（-89.28±3.47）（P＜0.05），梓醇聯(lián)合雷帕（-87.41±2.92）治療后與雷帕組相比并無差異性（P＞0.05）；術后第7天，與雷帕組（-88.32±4.19）相比梓醇組、梓醇聯(lián)合雷帕組（-70.12±1.90、-81.42±2.16）均具有顯著性差異（P＜0.01、P＜0.05）。
　　2.梓醇激活mTOR信號通路，抑制PTEN活性

19、
　　Western blot檢測結果:坐骨神經(jīng)損傷后，脊髓p-m-TOR(Ser2448)和磷酸化P70S6K(Thr389)蛋白表達上調(diào)；與模型組相比，梓醇組p-m-TOR(Ser2448)和磷酸化P70S6K(Thr389)蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；雷帕霉素顯著性抑制p-m-TOR和p-P70S6K（P＜0.05），同時部分抑制p-Akt(Ser473)表達（P＜0.05），梓醇聯(lián)合使用雷帕霉素后，部分逆轉了雷帕霉素

20、對m-TOR信號通路的抑制；模型組和雷帕霉素組的脊髓組織中的p-PTEN較假手術脊髓組織中增加（P＜0.05），梓醇組的p-PTEN與模型組相比是顯著降低的（P＜0.05）；
　　3.梓醇上調(diào)L4-L6脊髓BDNF的表達
　　梓醇組較模型組BDNF的表達明顯上調(diào)（P＜0.05），雷帕+梓醇組與雷帕組相比明顯增加（P＜0.05）；
　　4.梓醇促進脊髓和坐骨神經(jīng)GAP-43表達
　　坐骨神經(jīng)GAP-43免疫熒光顯示

21、，梓醇組的GAP-43陽性纖維呈連續(xù)性絲狀有序排列，接近于假手術組；模型組陽性神經(jīng)纖維較短，排列分散；脊髓GAP-43免疫熒光陽性細胞顯示，模型組前角運動神經(jīng)元陽性數(shù)目（9±1.2）與假手術組（19±3.1）相比有顯著性差異（P＜0.01）；梓醇組陽性數(shù)目（26±4.6）比模型組顯著性增加（P＜0.05）；Western blot半定量分析結果與上述形態(tài)學結果一致。
　　結論：梓醇上調(diào)BDNF和GAP-43的表達，激活m-TOR的

22、信號通路促進外周神經(jīng)軸突再生，改善坐骨神經(jīng)損傷導致的行為學功能缺陷。
　　本課題結論：
　　1.梓醇可促進坐骨神經(jīng)損傷后修復及功能的恢復，對血神經(jīng)屏障具有保護作用；
　　2.梓醇抑制坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的凋亡，對損傷的神經(jīng)元有保護作用，梓醇提高骨骼肌內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，延緩坐骨神經(jīng)損傷后運動終板的退變，阻止骨骼肌萎縮發(fā)生；
　　3.梓醇抑制PTEN活性，激活了m-TOR上下游信號，有利于坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)行為學