分泌IL-22的Th22細(xì)胞對(duì)小鼠病毒性心臟病心肌纖維化的作用.pdf

1、病毒性心臟病(viral heart disease，VHD)是與病毒感染有關(guān)的一組心血管疾病，包括病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)和擴(kuò)張型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)，其最常見的感染原是柯薩奇病毒(coxsackie virusB，CVB)。
　　Th22細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T輔助細(xì)胞亞群，其特征是分泌白介素-22(interleukin-22，IL-22)，而不分

2、泌白介素-17、白介素-4或干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)等因子。Th22細(xì)胞及IL-22在病毒性心肌炎中起到了抗感染與抗病毒的作用。
　　為了解Th22及IL-22是否參與VMC向DCM進(jìn)展的過(guò)程，闡明其在心肌纖維化中的作用，尋求治療DCM的新思路和新靶點(diǎn)，本課題將應(yīng)用BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射CVB3病毒的方法建立VHD模型，進(jìn)行以下的研究。
　　第一部分:小鼠病毒性心臟病各階段心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的變

3、化
　　本部分包括以下兩個(gè)方面的研究:1.小鼠病毒性心臟病模型的建立及心肌病理改變;2.小鼠病毒性心臟病各階段纖維化相關(guān)指標(biāo)變化。
　　100只4周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為急性病毒性心肌炎(acute viralmyocarditis，AVMC)組(n=20)、慢性病毒性心肌炎(chronic myocarditis)組(n=20)、DCM組(n=30)及對(duì)照組(n=30)。采用腹腔接種CVB3建立小鼠AVMC模型、慢

4、性病毒性心肌炎模型及DCM模型，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)。各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)取血，分離血漿，無(wú)菌取心臟和脾。HE染色了解心肌病理組織學(xué)改變，Masson染色了解心肌纖維化程度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time RT-PCR)檢測(cè)心肌組織纖維化相關(guān)指標(biāo)Ⅰ型膠原-A1(collagen typeⅠ-A1，COL1-A1)、Ⅲ型膠原-A1(collagen typ

5、eⅢ-A1，COL3-A1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP9)及金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA的表達(dá);酶聯(lián)免疫雙夾心抗體法(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　大體標(biāo)本顯示AVMC小鼠心室大小無(wú)變化;慢性病

6、毒性心肌炎小鼠心腔無(wú)明顯擴(kuò)大，但可見少量片狀纖維化病灶;DCM小鼠左室腔明顯擴(kuò)大，室壁變薄。病理切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色顯示AVMC小鼠心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞變性壞死、間質(zhì)有大量炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)，有心肌纖維化發(fā)生，但僅局限在心肌壞死灶周邊;慢性病毒性心肌炎小鼠無(wú)明顯心肌纖維斷裂，心肌內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，心肌間質(zhì)纖維化明顯;DCM小鼠心肌間質(zhì)大量膠原異常增生，呈彌漫性分布而幾無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)纖

7、維化較慢性期更為明顯。心肌組織切片Masson染色顯示，心肌纖維化程度進(jìn)行性增加，各階段膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）的變化有顯著性差異。同時(shí)外周血ELISA及心肌組織RT-PCR顯示與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組相比，AVMC組、慢性病毒性心肌炎組及DCM組纖維化相關(guān)指標(biāo)COL1-A1、COL3-A1、MMP9呈升高趨勢(shì)，MMP9相關(guān)抑制因子TIMP-1呈降低趨勢(shì)。
　　AVMC、慢性病毒性心肌炎及DC

8、M造模成功，隨VHD病情進(jìn)展，心肌纖維化程度呈進(jìn)行性加重。
　　第二部分:Th22細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子IL-22在VHD中的表達(dá)
　　本部分包含以下兩個(gè)方面的研究:1.小鼠VHD演變過(guò)程中Th22細(xì)胞亞群的變化趨勢(shì);2.小鼠VHD演變過(guò)程中Th22分泌的相關(guān)因子IL-22、IL-22受體(IL-22 receptor，IL-22R)的表達(dá)變化趨勢(shì)。
　　各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)無(wú)菌取血，分離血清，無(wú)菌取心臟和脾。流式細(xì)

9、胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS)檢測(cè)小鼠脾Th22細(xì)胞數(shù)量百分比。ELISA檢測(cè)血清中IL-22蛋白的表達(dá);免疫組化檢測(cè)小鼠心肌組織IL-22R表達(dá)水平。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS對(duì)各組小鼠脾臟Th22細(xì)胞與IL-22、IL-22R進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　Th22細(xì)胞比例及其相關(guān)因子循環(huán)血清IL-22、心肌IL-22R蛋白表達(dá)在AVMC組、慢性病毒性心肌炎組及DCM組均較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組增

10、高，且Th22細(xì)胞百分比與循環(huán)血清IL-22、心肌IL-22R蛋白表達(dá)存在正相關(guān)，提示Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子參與了小鼠VHD的演變過(guò)程。
　　第三部分:抗IL-22抗體對(duì)小鼠病毒性心肌炎心肌纖維化的干預(yù)作用
　　該部分包含以下三個(gè)方面的研究:1.抗IL-22抗體（anti-IL-22 antibody，Anti-IL-22 Ab）對(duì)病毒性心肌炎小鼠Th22細(xì)胞、IL-22、IL-22R表達(dá)的影響;2.抗IL-22抗體對(duì)病毒

11、性心肌炎小鼠及其心肌病理變化的影響;3.抗IL-22抗體對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化及其相關(guān)指標(biāo)的影響。
　　4周齡雄性BABL/c小鼠60只，隨機(jī)分成week2組(n=30)及week12組(n=30)，每組中又分成三個(gè)亞組:抗IL-22抗體組(Anti-IL-22 Ab組，n=10)、同型對(duì)照組（IgG組，n=10）、PBS組(n=10)。全部小鼠均腹腔注射CVB3病毒液，注射病毒當(dāng)天定義為第0天。week2組中Anti-IL

12、-22Ab、IgG和PBS亞組小鼠在第0天分別腹腔注射50μg Anti-IL-22 Ab、50μg同型對(duì)照IgG和50μg PBS;week12組中的三個(gè)亞組存活小鼠尚需在第28天及第56天注射CVB病毒液，其三個(gè)亞組的存活小鼠需在第0天、第28天、第56天分別腹腔注射50μg Anti-IL-22 Ab、50μg同型對(duì)照IgG和50μg PBS。各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)取血，分離血清，無(wú)菌取心臟和脾。Masson染色了解心肌纖維化程度;流

13、式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脾Th22亞群細(xì)胞數(shù)量;免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠心肌組織IL-22R表達(dá)水平;RT-PCR檢測(cè)小鼠心肌組織中COL1-A1、COL3-A1、MMP9、TIMP-1 mRNA的表達(dá); ELISA檢測(cè)小鼠血漿中IL-22、COL1-A1、MMP9、TIMP-1的表達(dá)水平。
　　結(jié)果顯示，與注射同型對(duì)照IgG或PBS相比，不論在急性或慢性病毒性心肌炎期，Anti-IL-22 Ab可減少CVB3病毒感染小鼠脾臟Th22細(xì)胞、血清

14、中IL-22水平及心肌中IL-22R的含量，增加小鼠的死亡率，升高心肌及血清中心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的mRNA及蛋白水平，加劇小鼠心肌的纖維化程度，使抗體干預(yù)后慢性病毒性心肌炎期小鼠的心肌纖維化程度更趨于接近抗體未干預(yù)時(shí)的DCM期（CVF0.30±0.07 vs.0.24±0.09，p＞0.05），加速心肌纖維化病程的進(jìn)展。
　　通過(guò)Anti-IL-22 Ab的拮抗作用，我們可以觀察到隨著Th22細(xì)胞百分比、血清IL-22、心肌組織I

15、L-22R的降低，AVMC及慢性病毒性心肌炎小鼠生存率明顯降低，心肌纖維化進(jìn)程加快，而且抗體干預(yù)后的小鼠在慢性病毒性心肌炎期的心肌纖維化程度已與未干預(yù)時(shí)的DCM期相當(dāng)，與之相伴的是纖維化相關(guān)因子COL1-A1、COL3-A1、MMP9的增加及TIMP-1的降低。該結(jié)果提示分泌IL-22的Th22細(xì)胞通過(guò)對(duì)心肌纖維化相關(guān)因子的干預(yù)，在VHD進(jìn)程中起到延緩心肌纖維化和保護(hù)心肌的作用。
　　總之，分泌IL-22的Th22細(xì)胞是AVMC向

16、慢性病毒性心肌炎甚至DCM發(fā)展過(guò)程中的重要細(xì)胞，它通過(guò)抑制纖維化相關(guān)指標(biāo)，延緩心肌纖維化進(jìn)程，發(fā)揮保護(hù)心肌的重要作用。
　　本課題研究結(jié)果提示:
　　CVB3導(dǎo)致的小鼠VHD模型中，隨病情進(jìn)展，心肌纖維化程度呈進(jìn)行性加重。小鼠Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-22、IL-22R在AVMC、慢性病毒性心肌炎期及DCM期均較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組增高，且Th22細(xì)胞數(shù)與IL-22、IL-22R存在正相關(guān)，提示Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子參與小鼠V