HMGB1在膿毒癥小鼠心肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)水平及其對心肌纖維化中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 高遷移率族蛋白B1(highmobilitygroupproteinB1，HMGB1)參與膿毒癥和心血管疾病發(fā)生發(fā)展，但在膿毒癥狀態(tài)下其對心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts，CFs)的作用尚未見報道。鑒于心肌纖維化是心功能衰竭的重要病理特征，本研究探討了小鼠CFs細(xì)胞在LPS刺激下分泌HMGB1的能力及其可能的分子機(jī)制;分析了CFs細(xì)胞分泌的HMGB1在Ⅰ、Ⅲ型膠原和骨橋蛋白表達(dá)中的作用;并以膿毒

2、癥小鼠模型為研究對象，整體觀察了HMGB1對心肌纖維化及心功能的影響。
　　 方法:
　　 (1)HMGB1及其相關(guān)受體的檢測:體外分離和培養(yǎng)小鼠CFs細(xì)胞，PCR檢測HMGB1相關(guān)受體TLR2/4/9和RAGE等的表達(dá)。用LPS(500ng/ml)刺激CFs細(xì)胞后，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的活性;利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、Westernblot及免疫熒光染色檢測HMGB1的表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)定位情況;同時利用q

3、RT-PCR和Westernblot檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和骨橋蛋白mRNA、蛋白的表達(dá)水平。
　　 (2)HMGB1表達(dá)與PKCβ-Erk1/2信號通路關(guān)系的分析:體外采用LPS刺激細(xì)胞后，通過Westernblot方法檢測PKCβ-Erk1/2信號分子的活化情況;PKCβ抑制劑阻斷后Westernblot檢測HMGB1的表達(dá)情況。
　　 (3)HMGB1對CFs細(xì)胞的刺激作用:體外應(yīng)用rHMGB1刺激CFs細(xì)胞，Weste

4、rnblot法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和骨橋蛋白，同時用PKCβ抑制劑或EP進(jìn)行HMGB1的阻斷試驗。
　　 (4)小鼠膿毒癥模型的誘導(dǎo)及HMGB1與心肌纖維化關(guān)系的體內(nèi)研究:腹腔注射LPS(10mg/kg)誘導(dǎo)小鼠膿毒癥模型，B超檢測LPS注射24小時后小鼠心臟收縮功能的變化。免疫熒光法檢測膿毒癥小鼠心肌組織HMGB1的水平，并用天狼星紅染色評估其膠原沉積情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)成功分離小鼠CFs細(xì)胞，其

5、表面表達(dá)TLR2及TLR4，未檢測到TLR9和RAGE的明顯表達(dá)。LPS(500ng/ml)刺激CFs細(xì)胞48h后細(xì)胞活性無明顯變化，qRT-PCR及Westernblot顯示HMGB1的表達(dá)明顯增高，與未處理組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。免疫熒光染色觀察到HMGB1由細(xì)胞核向細(xì)胞漿的易位，并在細(xì)胞上清中檢測到HMGB1。
　　 (2)經(jīng)Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，LPS刺激CFs細(xì)胞后信號分子PKCβ-Erk1/2的

6、磷酸化水平明顯增高，而PKCβ抑制劑處理后，CFs細(xì)胞分泌HMGB1的水平降低。
　　 (3)通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，LPS刺激CFs細(xì)胞后Ⅰ、Ⅲ型膠原和骨橋蛋白的mRNA與蛋白表達(dá)均明顯增加;PKCβ抑制劑和EP抑制內(nèi)源性HMGB1釋放后，膠原和骨橋蛋白的表達(dá)下調(diào)。同時，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，外源性rHMGB1刺激CFs細(xì)胞后Ⅰ型膠原和骨橋蛋白表達(dá)明顯增加。
　　 (4)體內(nèi)研究發(fā)

7、現(xiàn)，膿毒癥小鼠心肌組織HMGB1表達(dá)水平明顯增高，膿毒癥后期心肌組織出現(xiàn)大量膠原沉積。B超檢測結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠心臟收縮功能明顯下降，EP治療后收縮功能明顯改善。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本研究發(fā)現(xiàn)CFs細(xì)胞在LPS刺激后能主動分泌HMGB1，其分泌可能是通過激活PKCβ-Erk1/2信號通路。
　　 (2)體內(nèi)、外實驗研究表明，HMGB1能增強(qiáng)心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)Ⅰ、Ⅲ膠原和骨橋蛋白的表達(dá)。膿毒癥小鼠HMGB