NLS和DMSO提高核糖體區(qū)打靶載體轉染效率的研究.pdf

1、非病毒載體因為安全性好、操作簡便、免疫原性低等方面而優(yōu)于病毒載體。但是較低的轉染效率和治療基因的短暫表達嚴重限制了其臨床應用。我室構建的人核糖體區(qū)打靶載體pHrneo，可以高效定點整合到rDNA區(qū)（定點整合率10-5-10-4）而使外源基因得到長期的表達。人皮膚成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）因為易于操作和培養(yǎng)而成為ex vivo基因治療策略中的理想靶細胞，但是較低的轉染效率，限制了其在臨床基因治療研

2、究中的應用。當質粒較大時（一般超過10kb，MW>700KD），其在細胞質中被阻滯的時間就會越長，轉染率也會迅速下降。攜帶治療基因的重組pHrneo質粒一般為10-16kb，細胞質及核膜的阻滯作用是其轉染效率低下的重要原因。 目的：為提高人核糖體區(qū)打靶載體的轉染效率，我們采用了兩種策略促進質粒DNA（pDNA）進入細胞核，以降低細胞質及核膜阻滯對轉染效率的影響：1）核定位信號（nuclear location signal，N

3、LS）促進質粒DNA快速進入細胞核，使其在被細胞質中核酸酶降解之前得以表達，從而達到提高轉染效率的目的；2）兩親性小分子可以干擾核孔復合體的疏水結構，從而打破核膜障礙，促進質粒DNA進入細胞核，提高轉染效率。 方法：1）：利用NLS與重組pHrneo質粒通過靜電作用結合，0.6％瓊脂糖凝膠阻滯實驗檢測偶聯效果；DNase I模擬細胞質內的核酸酶酶切，評價NLS對pDNA的保護作用；不同偶聯比例的NLS/pHrnGFP復合物利用

4、聚乙烯亞胺（PEI）法轉染人皮膚成纖維細胞，48小時后流式細胞儀檢測GFP表達效率；轉染Cy3標記pHrnGFP后1小時，激光共聚焦顯微鏡檢測質粒的亞細胞位置。2）DMSO預處理HDF后Lipofectamine2000轉染pHrnGFP，24小時后流式細胞儀檢測GFP表達效率；流式細胞儀分析DMSO處理對HDF的細胞周期的影響；轉染Cy3標記pHrnGFP后30分鐘，激光共聚焦顯微鏡檢測質粒的亞細胞位置。MTT實驗評價NLS及DMSO

5、對HDF的細胞毒性。 結果：1）瓊脂糖凝膠實驗顯示NLS與pDNA偶聯后可以降低其在凝膠中的遷移速度；當NLS/pHrnGFP偶聯比例大于2×104時，可以在一定程度上防止DNase I的降解，并顯著提高人核糖體區(qū)打靶載體pHrnGFP的轉染效率4-5倍。激光共聚焦顯微鏡觀察NLS可以促進pHrnGFP在1小時內進入細胞核。2）應用2％DMSO預處理HDF48小時后，再采用Lipofectamine2000法進行轉染，可以顯著

6、提高pHrnGFP的轉染效率2-3倍；DMSO處理后90％的HDF阻滯在G1期，除去DMSO后HDF繼續(xù)增殖；激光共聚焦顯微鏡下觀察，pHrnGFP可以在30分鐘內進入DMSO處理細胞的細胞核。 結論：NLS可以促進人核糖體區(qū)打靶載體快速進入細胞核，并顯著提高核糖體區(qū)打靶載體轉染HDF的效率。應用2％ DMSO預處理HDF48小時，可以有效干擾核孔復合體的疏水結構，顯著提高核糖體區(qū)打靶載體的轉染效率。兩種方法為核糖體區(qū)打靶載體