牛梨形蟲核糖體RNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的測定及應(yīng)用.pdf

1、牛梨形蟲病(舊稱焦蟲病)是由頂復(fù)門、梨形蟲綱、梨形蟲目中的巴貝斯科(Babesiidae)巴貝斯屬(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileria)的多種原蟲寄生于牛的紅細胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞內(nèi)所引起的一類疾病的統(tǒng)稱,以高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿或體表淋巴結(jié)腫大為主要特征,嚴重時可引起動物死亡.本病在我國分布廣、危害嚴重,常常給疫區(qū)的養(yǎng)牛業(yè)造成巨大損失. 本研究用實驗室內(nèi)分離保藏的牛梨形蟲病病原,包括:5種

2、牛巴貝斯蟲(9株)和3種泰勒蟲(7株),感染實驗動物,采集染蟲血液,提取基因組DNA,設(shè)計適當引物,利用PCR方法擴增核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSl-5.8S-ITS2),將擴增產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體,進行核苷酸序列測定.結(jié)果顯示,巴貝斯蟲轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核苷酸片段的大小在577bp-750 bp之間,泰勒蟲在916-1074bp.用所測得的ITSl-5.8S-ITS2、ITSl、5.8S和ITS2序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,并

3、進行同源性比較.結(jié)果顯示:我國牛的梨形蟲可明顯分為泰勒蟲和巴貝斯蟲兩枝,與傳統(tǒng)分類方法及18S rRNA系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果基本一致.巴貝斯蟲的ITSl和ITS2核苷酸區(qū)段變異較大,種間同源性分別在4.4﹪-97.7﹪,有時甚至超過種內(nèi)不同地方株之間的關(guān)系,但在ITSl-5.8S-ITS2、ITSl和ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)生樹上,牛巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲未定種新疆株均自成一枝,雙芽巴貝斯蟲與卵形巴貝斯蟲共處一枝,位于卵形巴貝斯蟲汶川

4、株與卵形巴貝斯蟲其它3個分離株之間;5.8S較保守,種間同源性在61.3﹪.100﹪之間,系統(tǒng)發(fā)生樹上各種巴貝斯蟲的分布與ITSl-5.8S-ITS2、ITSl和ITS2系統(tǒng)發(fā)生樹基本一致.泰勒蟲ITSl和ITS2區(qū)段種內(nèi)變異較小,種內(nèi)地方分離株之間的同源性遠遠大于種間同源性;環(huán)形泰勒蟲3個地方株之間ITSl-5.8S-ITS2、ITSl、5.8S和ITS2序列的同源性分別為92.2﹪-94.2﹪、91.2﹪-93.1﹪、97.5﹪-9

5、8.1﹪和92.7﹪-95.3﹪,瑟氏泰勒蟲3個地方株之間4個核苷酸區(qū)段的同源性分別為97.0﹪-97.9﹪、96.2﹪-97.3﹪、98-7﹪.99.4﹪和97.8﹪-99.3﹪,中華泰勒蟲3個地方株之間4個核苷酸區(qū)段的同源性分別為98.3﹪-99.6﹪、98.2﹪-99.5﹪、99.4﹪-100.0﹪和97.7﹪-100.0﹪;而環(huán)形泰勒蟲與瑟氏泰勒蟲4個核苷酸區(qū)段之間的同源性分別為18.3﹪-35.7﹪、5.4﹪-5.6﹪、95.

6、6﹪-98.1﹪和12.3﹪-14.8﹪,環(huán)形泰勒蟲與中華泰勒蟲4個核苷酸區(qū)段之間的同源性分別為18.7﹪-36.5﹪、8.9﹪-11.8﹪、94.9﹪-97.5﹪和9.1﹪-20.7﹪,瑟氏泰勒蟲與中華泰勒蟲4個核苷酸區(qū)段之間的同源性分別為54.2﹪-55.3﹪、29.7﹪-33.0﹪、96.2﹪-98.1﹪和61.0﹪-61.7﹪;在所建立的4個系統(tǒng)發(fā)生樹上,環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲分處于3個分枝上.該結(jié)果比18SrRNA

7、基因更清楚的揭示:我國存在三種牛的泰勒蟲,它們是環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲,中華泰勒蟲是不同于其它泰勒蟲的一個有效種. 根據(jù)已測定的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基核苷酸列設(shè)計牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的特異性引物,建立了一種能夠同時檢測牛巴貝斯蟲和牛雙芽貝斯蟲的多重PCR檢測方法,且與其它梨形蟲病病原沒有交叉反應(yīng),對雙芽巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲混合感染血樣的檢測敏感性分別可達到10<'-5>10<'-4>.通過對114份人工感染及治療后所