凝血酶的新型適配體-懸浮芯片檢測技術(shù)及作用機(jī)制研究.pdf

1、核酸適配體由于其具有分子量小、制備簡單、高親和力、高特異性等多種優(yōu)點(diǎn)，逐漸替代抗體作為一種新型的生物識別元件，有望廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、檢測分析和臨床診斷等諸多領(lǐng)域。懸浮芯片技術(shù)是一種高通量、低背景的生物芯片技術(shù)，以熒光編碼微球作為檢測探針載體進(jìn)行靶標(biāo)物的快速靈敏檢測。本研究將適配體與懸浮芯片技術(shù)相結(jié)合，以經(jīng)典模式靶標(biāo)物凝血酶作為檢測目標(biāo)，建立高親和力和高特異性的適配體-懸浮芯片檢測新技術(shù)。
　　將氨基化的15mer的適配體（T

2、hrombin binding aptamer1，TBA1）修飾在磁性羧基化微球表面制備成探針微球，用于捕獲溶液和血液樣品中的凝血酶，生物素化的29mer的適配體（Thrombin binding aptamer2，TBA2）作為報(bào)告探針與凝血酶結(jié)合，形成在微球上穩(wěn)定的三明治夾心復(fù)合物，經(jīng)過磁分離，將此復(fù)合物與溶液中未偶聯(lián)靶標(biāo)物分離。通過鏈霉親和素-生物素的反應(yīng)系統(tǒng)將熒光報(bào)告蛋白鏈霉親和素-藻紅蛋白（Strepavidin-phycoe

3、rythrin，SA-PE）連接到報(bào)告探針TBA2上，由懸浮芯片系統(tǒng)檢測得到中位熒光強(qiáng)度值（Median Fluorescence Intensity， MFI）。通過優(yōu)化，獲得了最佳檢測孵育條件和最佳偶聯(lián)方案。在最佳檢測條件和偶聯(lián)方案下，建立了凝血酶檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測范圍18.37-554.31 nM（IC10-IC90）最低檢出限為5.4 nM，說明檢測方法具有較高的檢測靈敏度和精確度。經(jīng)過特異性測定實(shí)驗(yàn)證明了適配體-懸浮芯片檢測技

4、術(shù)檢測凝血酶具有良好的特異性。對人血清中進(jìn)行凝血酶加標(biāo)回收率的測定，加標(biāo)回收率在82.6-114.2％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，獲得了滿意的回收率效果，該檢測技術(shù)有望成功應(yīng)用于臨床診斷的高通量樣品檢測。
　　在建立適配體-懸浮芯片檢測新技術(shù)的同時(shí)，對TBAs與凝血酶之間的分子間相互作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。利用微量熱泳動(dòng)技術(shù)（Microscale thermophoresis，MST）證實(shí)TBAs與凝血酶間具有很高的親和力。M