丹參酮ⅡA磺酸鈉誘導(dǎo)乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞分化中的作用及細(xì)胞密度對誘導(dǎo)的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞提取、生物學(xué)性質(zhì)觀察及丹參酮ⅡA磺酸鈉對兩種細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響
　　背景：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)功能是造血和細(xì)胞功能支持，該細(xì)胞的數(shù)量是隨著年齡增大而降低的;呈典型的長梭形，漩渦狀生長，具有很強(qiáng)的分化潛能;軟骨細(xì)胞(Chondrocyte)是軟骨組織的唯一細(xì)胞種類。軟骨細(xì)胞生成和維持軟骨基質(zhì)（主要包括膠原和蛋白聚糖）。針對人類軟骨損傷修復(fù)，仍然亟

2、待解決，其生長單層性質(zhì)和環(huán)境要求導(dǎo)致不能單純擴(kuò)增解決修復(fù)。細(xì)胞組織工程應(yīng)用在這方面逐漸廣泛。
　　目的：分離乳兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并傳代培養(yǎng)、利用多種檢測方法觀察其生物學(xué)性狀。研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞的體外擴(kuò)增的作用;驗證其對兩種細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用及尋找出均促進(jìn)兩種細(xì)胞增長進(jìn)行進(jìn)一步實驗的最佳藥物濃度。
　　方法：選用全骨髓貼壁分離法進(jìn)行乳兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離;二步酶消化法乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨取

3、材獲取軟骨細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生物學(xué)形狀和相關(guān)檢測進(jìn)行鑒定;等比稀釋法配制15種不同濃度的丹參酮ⅡA磺酸鈉溶液，分別單獨培養(yǎng)乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞以及兩種細(xì)胞以1∶1比例混合細(xì)胞群，繪制細(xì)胞生長曲線;探索最佳藥物濃度。
　　結(jié)果：乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察分別長梭形和短梭形，相關(guān)檢測均鑒定為目的細(xì)胞，且丹參酮ⅡA磺酸鈉培養(yǎng)1∶1比例混合細(xì)胞時呈現(xiàn)增長，最佳濃度是50ug/ml，而單獨細(xì)胞培養(yǎng)時在區(qū)間37.5u

4、g/ml至62.5ug/ml，因此50ug/ml作為進(jìn)一步實驗研究的最佳培養(yǎng)濃度。
　　結(jié)論：乳兔BMSCs和軟骨細(xì)胞提取選擇全骨髓貼壁法和二步酶消化法可行;丹參酮ⅡA磺酸鈉最佳實驗濃度應(yīng)為50ug/ml。
　　第二部分 丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用的研究
　　目的：研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用。
　　方法：設(shè)立只更換培養(yǎng)基的正常乳兔BMSCs陰性對照組、最

5、佳丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度的誘導(dǎo)實驗組和加TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系的陽性對照組;12孔板作培養(yǎng)板，孔底置爬片，誘導(dǎo)7天、14天、21天后分別取出爬片進(jìn)行番紅O染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色、FDA/PI熒光等檢測和利用RT-PCR定量檢測蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)量，驗證丹參酮ⅡA磺酸鈉在乳兔乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用的大小。
　　結(jié)果：陰性對照組的乳兔BMSCs未發(fā)生性狀的明顯改變，各種檢測均未呈陽性表現(xiàn);實驗

6、組和TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化，逐漸由長梭形變?yōu)槎趟笮位蚨噙呅危鞣N檢測均為陽性表現(xiàn)，且在誘導(dǎo)過程中，時間越長，乳兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞量最多，但TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組明顯多于實驗組，RT-PCR檢測顯示在實驗組和TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組均有蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，實驗組低于TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系組。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA磺酸鈉能促進(jìn)乳兔BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。
　　第三部分 細(xì)

7、胞種板密度對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用影響的研究
　　目的：研究細(xì)胞種板密度對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用影響。
　　方法：分別對12孔板種不同密度的乳兔BMSCs，分為三組，低密度組，中密度組和高密度組;均使用TGF-β1軟骨誘導(dǎo)體系進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實驗，定期更換培養(yǎng)液，誘導(dǎo)14天后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、Ⅱ型膠原免疫組化染色、FDA/PI熒光顯影和RT-PCR等檢測，驗證細(xì)胞密度對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程的影響。
　　結(jié)果：三組誘導(dǎo)14天后均有明顯的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變