低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)BMSCs增殖及向軟骨細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】
　　觀察低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)體外全骨髓貼壁篩選法獲取的BMSCs增殖的調(diào)節(jié)作用。探索LIPUS聯(lián)合TGF-β1促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的協(xié)同效應(yīng)。
　　【方法】
　　1.通過分離提取四周齡日本大耳白兔的骨髓液，在體外采用全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增，得到足夠數(shù)量級(jí)具備良好生物學(xué)活性的 BMSCs，光鏡下觀察BMSCs形態(tài)變化、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞質(zhì)中II型膠原合成分泌情況、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測BMS

2、Cs表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD90、CD105，對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定。
　　2.設(shè)定不同刺激強(qiáng)度(30、60、90 mW/cm2)和刺激時(shí)間(5、10、15、20 min)的參數(shù)組合，對(duì)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的第3代BMSCs進(jìn)行LIPUS刺激，24 h后光鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，并采用 Cell Counting Kit-8試劑盒檢測不同參數(shù)下LIPUS對(duì)離體培養(yǎng)的BMSCs增殖的作用，優(yōu)選出可促進(jìn)BMSCs增殖的最佳LIPUS參數(shù)；

3、
　　3.選取離體培養(yǎng)的第3代BMSCs，分為4組：空白對(duì)照組(Blank Control組)、單純TGF-β1組(T組)、單純LIPUS組(L組)、TGF-β1＋LIPUS組(T-L組)。其中，空白對(duì)照組：培養(yǎng)基中不加TGF-β1，不予以LIPUS刺激；單純TGF-β1組(T組)：培養(yǎng)基中加入TGF-β1進(jìn)行培養(yǎng)，不予以LIPUS刺激；單純LIPUS組(L組)：不加入TGF-β1，予以前期篩選出的最佳參數(shù)的LIPUS刺激；TGF

4、-β1＋LIPUS組(T-L組)：在培養(yǎng)基中加入TGF-β1后給予最佳參數(shù)的LIPUS刺激，各組均分別在干預(yù)的第1、3、7天后觀察，應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞質(zhì)中II型膠原的合成分泌情況，應(yīng)用番紅O-固綠染色檢測軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成分泌情況，應(yīng)用 RT-PCR法檢測細(xì)胞 SOX9、COL2A1、MMP13 mRNA的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】
　　1.體外分離培養(yǎng)的BMSCs生長狀態(tài)良好，貼壁能力強(qiáng)，光鏡下觀察，穩(wěn)定增殖

5、后的細(xì)胞形態(tài)呈梭形或紡錘形，大小形態(tài)較為一致。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示：COL-II染色呈陰性，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測顯示：BMSCs均一表達(dá)CD90和CD105，陽性率分別為99.78％和99.52%，而CD34和CD45的陽性率分別為0.35%和0.56%，確認(rèn)培養(yǎng)的細(xì)胞為表型穩(wěn)定的未分化BMSCs。
　　2.不同參數(shù)組LIPUS刺激細(xì)胞后24 h鏡下觀察：LIPUS刺激后的細(xì)胞呈漩渦狀排列，整體分布更加緊密，形成很多 BMSCs

6、集簇，尤以超聲強(qiáng)度60 mW/cm2，作用時(shí)間15 min最為明顯。CCK-8法檢測結(jié)果顯示：不同參數(shù)LIPUS刺激后BMSCs增殖情況均優(yōu)于空白對(duì)照組，其中超聲強(qiáng)度60 mW/cm2，作用時(shí)間15 min組細(xì)胞的OD值均數(shù)最大，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示：空白對(duì)照組可見COL-II染色呈陰性，而T組和L組的COL-II染色呈陽性，其中，T-L組最顯著。番紅O-固綠染色：空白對(duì)照組的細(xì)

7、胞外基質(zhì)中在第1、3、7天都未見明顯的紅染出現(xiàn)；而L組和T組細(xì)胞外基質(zhì)中第1天出現(xiàn)較少量紅染，第3、7天紅染區(qū)逐漸增多；T-L組細(xì)胞外基質(zhì)中第1、3、7天均有紅染出現(xiàn)，且紅染區(qū)呈現(xiàn)逐漸擴(kuò)大的趨勢。RT-PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組各組在第1、3、7天SOX9和COL2A1表達(dá)上調(diào)，而MMP13的表達(dá)量下調(diào)，T-L組的SOX9和COL2A1表達(dá)上調(diào)量和MMP13下調(diào)量更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　【結(jié)論】
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8、．通過全骨髓貼壁篩選法可獲得生物活性良好、增殖能力強(qiáng)、形態(tài)一致、表型穩(wěn)定的BMSCs，全骨髓貼壁篩選法操作簡單、易于掌握，對(duì)獲得優(yōu)質(zhì)BMSCs種子細(xì)胞具有重要意義。
　　2．自行構(gòu)建的低強(qiáng)度脈沖超聲刺激細(xì)胞裝置符合實(shí)驗(yàn)需求。適宜參數(shù)的低強(qiáng)度脈沖超聲可促進(jìn)離體培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，促細(xì)胞增殖效應(yīng)與超聲刺激參數(shù)有相關(guān)性，本研究中，超聲強(qiáng)度60 mW/cm2，作用時(shí)間15 min促增殖效率最佳。
　　3．單獨(dú)應(yīng)用LIPUS