時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定環(huán)境雌激素的研究.pdf

1、時(shí)間分辨熒光免疫分析法是近十年發(fā)展起來(lái)的一種微量分析方法,是利用免疫反應(yīng)的高特異性和標(biāo)記示蹤物的高度靈敏性相結(jié)合而建立的一類(lèi)非放射性的新興檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)以其具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然光干擾、無(wú)放射性污染、多標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)逐漸為人們所重視。由于環(huán)境雌激素對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有較強(qiáng)的干擾作用,可以導(dǎo)致畸形、發(fā)育異常、生殖功能障礙、代謝紊亂、癌癥等。環(huán)境雌激素種類(lèi)繁多分布廣泛,不僅影響人類(lèi)健康,也威脅到生物物種的存亡。建立

2、環(huán)境雌激素的分析檢測(cè)方法對(duì)于研究環(huán)境雌激素類(lèi)物質(zhì)的遷徙、轉(zhuǎn)化、作用機(jī)理等方面具有重要的意義,已成為國(guó)際上分析化學(xué)和環(huán)境化學(xué)的熱門(mén)話(huà)題。
　　本論文在稀土元素標(biāo)記抗體的制備、免疫分析方法的建立方面展開(kāi)工作。建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定單組份的方法,同時(shí)利用雙標(biāo)記技術(shù)對(duì)雙組份進(jìn)行測(cè)定,建立了雙組份同時(shí)測(cè)定的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法。這些方法對(duì)推動(dòng)新型環(huán)境監(jiān)測(cè)方法的研究及擴(kuò)大生物技術(shù)的應(yīng)用,具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
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3、為以下五部分:
　　一、完全抗原的合成和標(biāo)記抗體的制備
　　雌二醇、雌三醇、己烯雌酚和雙酚 A分子量較小,它們都是半抗原小分子,小分子本身不能被現(xiàn)有的固相載體吸附,必須與大分子載體偶聯(lián)后,才能通過(guò)載體的作用將半抗原包被到固相載體上。本文合成了雌二醇、雌三醇、己烯雌酚和雙酚A的完全抗原,同時(shí)利用稀土離子標(biāo)記了抗體。
　　二、時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定己烯雌酚
　　以二乙烯三胺五乙酸酐(DTPAA)為銪的螯合劑,采用兩

4、步法標(biāo)記抗己烯雌酚(DES)抗體,建立了競(jìng)爭(zhēng)型時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定己烯雌酚(DES)的新方法,比普通熒光免疫分析靈敏度提高100倍,在0.001~100 ng/mL之間有良好的線性,其線性回歸方程為ΔI(I0-I)=2855.44lgC+11351.3,相關(guān)系數(shù)為0.9933,檢測(cè)限為1pg/mL,最低檢出限為0.595pg/mL。將此方法用于血清樣品和水樣的測(cè)定,并同時(shí)采用異硫氰光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔抗體為分析試劑的熒光免疫

5、分析方法做了對(duì)照試驗(yàn),相關(guān)性良好,測(cè)定結(jié)果令人滿(mǎn)意。
　　三、時(shí)間分辨熒光免疫分析法測(cè)定雙酚A
　　利用完全抗原包被微孔板,以銪標(biāo)記的抗雙酚A(BPA)抗體為分析試劑,建立了雙酚A的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)分析方法并對(duì)抗原濃度、抗體濃度、pH值等條件進(jìn)行了優(yōu)化。此方法在0.001~1000ng/mL之間有良好的線性,其線性回歸方程為ΔI(I0-I)=897.34lgC+3644.2,相關(guān)系數(shù)為0.9892,方法的檢測(cè)限為1pg/mL,最

6、低檢出限為0.623pg/mL。將此方法用于食品包裝袋浸取液,塑料瓶裝水和血清加標(biāo)樣品的測(cè)定,采用傳統(tǒng)的熒光免疫分析方法進(jìn)行了對(duì)照試驗(yàn),效果良好。
　　四、時(shí)間分辨熒光免疫分析同時(shí)測(cè)定己烯雌酚和雙酚A
　　采用銪和釤兩種稀土元素標(biāo)記的抗己烯雌酚抗體和抗雙酚抗體作為分析試劑,利用兩種不同的完全抗原同時(shí)包被微孔板,建立了競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)模式,利用時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)對(duì)己烯雌酚和雙酚A進(jìn)行了測(cè)定,其DES在0.0064ng/mL~5

7、00ng/mL有良好的線性,相關(guān)系數(shù)為0.9886,而B(niǎo)PA在0.032ng/mL~500ng/mL,線性相關(guān)系數(shù)為0.9928。將此方法用于水樣和血清樣品的測(cè)定,結(jié)果令人滿(mǎn)意。
　　五、雌二醇和雌三醇同時(shí)測(cè)定的時(shí)間分辨熒光免疫方法
　　以二乙烯三胺五乙酸酐(DTPAA)為雙功能螯合劑,采用兩步標(biāo)記法標(biāo)記了抗雌二醇(E2)抗體和抗雌三醇(E3)抗體,建立了競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)模式,利用時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)對(duì)雌二醇(E2)和雌三醇(