21209.新型時間分辨熒光免疫分析法檢測水產(chǎn)致病菌

1、囊簍夫?qū)W碩士學(xué)位論文新型時間分辨熒光免疫分析法檢測水產(chǎn)致病菌NewTimeresolvedFluoroimmunoassayforPathogenicBacteriainAquacuIture學(xué)位授予單位：篡差太堂論文答辯日期：2Q!量笙壁壘旦壁2旦新型時間分辨熒光免疫分析法檢測水產(chǎn)致病菌摘要我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，養(yǎng)殖規(guī)模位居世界前列。但目前的高密度集約化養(yǎng)殖使得病害發(fā)生日益頻繁，尤以細菌病最為嚴重，傳統(tǒng)的熒光抗體法、酶聯(lián)免疫分析法均

2、存在背景熒光較高，靈敏度低等缺陷，時間分辨熒光免疫分析法作為一種高靈敏的檢測方法已在食品、化學(xué)等領(lǐng)域引起重視；課題組首次應(yīng)用時間分辨熒光免疫分析法檢測了產(chǎn)酸克雷伯氏菌，我們在此基礎(chǔ)上探索了TRFIA檢測致病菌的新方法，主要內(nèi)容如下：l，建立了雙標(biāo)記TRFIA檢測嗜水氣單胞菌B18和產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12，將致病菌直接包被微孔板，Eu3IgG、Sm3IgG作為檢測抗體對其進行檢測，嗜水氣單胞菌B18和產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12檢測靈敏度均為101

3、06cfu／mL，靈敏度較低存在很大的可拓展空間。2為了進一步提高檢測靈敏度，將抗嗜水氣單胞菌B18抗體和抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12抗體包被微孔板，建立了嗜水氣單胞菌B18和產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12的雙抗夾心雙標(biāo)記TRFIA法，通過對包被IgG、Eu3IgG及Sm3IgG進行優(yōu)化產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12的檢測限達到1O104cfu／mL，嗜水氣單胞菌B27的檢測限為60104cfu／mL，標(biāo)準曲線在1O104。10107cfu／mL范圍內(nèi)線性良好，

4、相關(guān)系數(shù)達99％以上，均優(yōu)于目前常用的熒光抗體法及ELISA法，且特異性好、重復(fù)性好、亦可用于實際樣品檢測。3利用生物素標(biāo)記抗嗜水氣單胞菌抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素與其發(fā)生特異反應(yīng)后，先后加入反應(yīng)底物二氟苯水楊酸酯，在酶催化作用下，反應(yīng)產(chǎn)物能夠與Tb3_EDTA生成時間分辨熒光溶液，以此建立的酶放大時間分辨熒光分析法檢測嗜水氣單胞菌B18。標(biāo)準曲線在1010210106cfu／mL范圍內(nèi)線性良好，該方法的靈敏度為10102cfu／