HSF1對(duì)大鼠發(fā)熱過程中PO-AH區(qū)TRPV1表達(dá)的影響.pdf

1、前言:
　　生物體在高溫、毒物及感染等應(yīng)激原的作用下，表現(xiàn)出熱休克反應(yīng)，這一反應(yīng)主要通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而保護(hù)機(jī)體免受應(yīng)激的損傷。在正常情況下，HSF1存在于胞漿中且呈無(wú)活性的單體形態(tài);當(dāng)機(jī)體處于高溫、缺氧等應(yīng)激刺激下，HSF1便進(jìn)入細(xì)胞核，且由無(wú)活性的單體向三聚體轉(zhuǎn)化。細(xì)胞中HSP70的合成將明顯增加，從而增強(qiáng)機(jī)體抵抗熱損傷的能力。
　　本實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)，Trpv1是一種HSF1的靶基因，我

2、們推測(cè)在下丘腦組織中，HSF1可能是機(jī)體發(fā)熱過程中又一種重要的保護(hù)應(yīng)答元件。然而目前還沒有HSF1影響TRPV1蛋白表達(dá)水平的直接證據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)將探討HSF1的激活對(duì)TRPV1蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步地明確HSF1與TRPV1在體溫調(diào)節(jié)中的相互關(guān)系與作用機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果顯示，HSF1激活后可通過降低cAMP、PGE2等中樞正調(diào)節(jié)介質(zhì)的含量而限制體溫升高，TRPV1也可通過降低PGE2的含量限制體溫升高。因此，本

3、實(shí)驗(yàn)還將探討HSF1激活對(duì)PGE2的抑制作用是不是通過增加TRPV1表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。
　　材料與方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理
　　(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　選用健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重250～280g，基礎(chǔ)體溫（38±0.2）℃，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼育室溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度40％-60％，晝夜光照節(jié)律12h∶12h，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)操作按常規(guī)無(wú)菌規(guī)則進(jìn)行。
　　(2)

4、實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)1:在LPS致熱大鼠過程中，HSF1對(duì)PO/AH區(qū)TRPV1表達(dá)以及PGE2含量的影響
　　將動(dòng)物隨機(jī)分為6組:(1)正常對(duì)照組(N1): PO/AH區(qū)注入溶劑1μl(1％無(wú)水乙醇+6％Tween80+93％生理鹽水)，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(2)槲皮素組(Q): PO/AH區(qū)注入槲皮素（0.075mol/L）1μl，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(3) AMG9

5、810組(A)，PO/AH區(qū)注入AMG9810，按6μg·kg-1用無(wú)水乙醇+生理鹽水配制成1μ1，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(4) LPS組(L)，PO/AH區(qū)注射溶劑1μl，30min后經(jīng)腹腔注射LPS4ml·kg-1（20μg·ml-1，用生理鹽水配制）;(5) LPS+槲皮素組(L+Q)，PO/AH區(qū)注入槲皮素1μl，劑量同前，30min后經(jīng)腹腔注射LPS4ml·kg-1;(6) LPS+AMG9810組(

6、L+A)，PO/AH區(qū)注射AMG98101μl，劑量同前，30min后經(jīng)腹腔注射LPS4ml·kg-1。
　　實(shí)驗(yàn)2:大鼠物理加溫處理，檢測(cè)HSF1對(duì)PO/AH區(qū)TRPV1表達(dá)的影響
　　將動(dòng)物隨機(jī)分為5組:將動(dòng)物隨機(jī)分為4組:(1)正常對(duì)照組(N2)，PO/AH區(qū)注入溶劑1μl，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(2)槲皮素組(Q)，PO/AH區(qū)注入槲皮素（0.075mol/L）1μl，30min后經(jīng)腹腔注射

7、生理鹽水4ml·kg-1;(3)物理加溫組(H)，將大鼠置于人工氣候室，室溫控制39℃，相對(duì)濕度保持50％，持續(xù)2h;(4)物理加溫+槲皮素組(H+Q)，PO/AH區(qū)注入槲皮素1μl，劑量同前，30min后將大鼠置于人工氣候室，操作如前。
　　(3)大鼠下丘腦PO/AH區(qū)插管、體溫測(cè)量發(fā)射子植入和物理加溫處理
　　下丘腦PO/AH區(qū)插管:將大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)+25％烏拉坦以1:1比例腹腔麻醉，然后將其頭部固

8、定于立體定位儀上，暴露前囟。參照大鼠腦圖譜，左側(cè)PO/AH區(qū)(anterior:-0.3 mm，lateral:-0.8mm，ventral:+6.7 mm)插入一根不銹鋼管(23ga)，并留置與之相匹配的針芯，最后用牙科水泥固定。
　　體內(nèi)植入測(cè)量體溫的發(fā)射予:在麻醉狀態(tài)下，于大鼠腹腔植入遙測(cè)系統(tǒng)發(fā)射子。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，恢復(fù)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　物理加溫處理:將大鼠置于人工氣候室，室溫控制在39℃，相對(duì)濕度50％，保持2

9、小時(shí)。
　　二、體溫測(cè)量
　　應(yīng)用BW-200生理無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)測(cè)量大鼠體溫。實(shí)驗(yàn)前一日早上8時(shí)開始記錄大鼠基礎(chǔ)體溫，每隔30分鐘測(cè)量體溫1次，共測(cè)量6小時(shí)，取其平均值記為基礎(chǔ)體溫。實(shí)驗(yàn)均在早8時(shí)開始，各組在相應(yīng)處理后開始監(jiān)測(cè)體溫變化，每隔5分鐘自動(dòng)記錄體溫一次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　三、Western blotting檢測(cè)下丘腦PO/AH區(qū)HSF1三聚體表達(dá)量
　　取大鼠PO/AH區(qū)的腦組織，冰浴勻漿，4℃離心(1

10、2000 r·min-1，30 min)兩次，取上清。進(jìn)行蛋白定量后，向蛋白質(zhì)提取液中加入緩沖液（不含β-巰基乙醇），各樣品稀釋成同一濃度。各取總量為50μg的蛋白質(zhì)（未經(jīng)煮沸變性），通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加兔抗大鼠HSF1單克隆抗體(1∶1000)，二抗為羊抗兔IgG，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析。對(duì)照選用抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白的灰度比值作為該目的

11、蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　四、Western blotting檢測(cè)下丘腦PO/AH區(qū)TRPV1表達(dá)量
　　取大鼠PO/AH區(qū)的腦組織，冰浴勻漿，4℃離心(12000 r·min-1，30 min)兩次，取上清。進(jìn)行蛋白定量后，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加小鼠抗大鼠TRPV1單克隆抗體(1∶1000)，二抗為羊抗小鼠IgG，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析。對(duì)照選用抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應(yīng)β-a

12、ctin蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　五、腦內(nèi)PGE2含量的測(cè)定
　　大鼠處死后，迅速取出下丘腦PO/AH區(qū)50 mg，加入1ml PBS(pH7.4)（預(yù)先4℃冰?。?，檢測(cè)時(shí)樣本在冰浴中進(jìn)行處理，用勻漿器將標(biāo)本制成組織勻漿。離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），取上清放于-20℃?zhèn)溆谩０凑誔GE2酶聯(lián)免疫法試劑盒說(shuō)明書操作。PGE2含量用(ng· L-1)表示。
　　六、數(shù)據(jù)分析
　　所有

13、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，各組均數(shù)間差異的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析用相關(guān)性檢驗(yàn)分析法。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)1:在LPS致熱大鼠過程中，HSF1對(duì)PO/AH區(qū)TRPV1表達(dá)以及PGE2含量的影響
　　HSF1三聚體表達(dá)水平:N1組、Q組和A組無(wú)顯著差異;L組則明顯高于N1組，但與L+A組無(wú)顯著差異;L+Q組略低于L組，但仍顯著高于N1組。
　　TRPV1表達(dá)水平:N1組、Q組和A組無(wú)顯著差異

14、;L組則明顯高于N1組;L+Q組和L+A組均低于L組，但仍顯著高于N1組;L+Q組、L+A組兩者無(wú)明顯差異。
　　體溫:大鼠腹腔注射LPS（L組）可引起體溫升高，在4h時(shí)體溫達(dá)到高峰，隨后開始降低，在發(fā)熱期間L組各采樣時(shí)間點(diǎn)與正常組(N1組)比較體溫變化均有顯著性差異(P＜0.01)。當(dāng)預(yù)先在PO/AH區(qū)給予Que后腹腔注射LPS，即在L+Q組體溫也出現(xiàn)明顯升高，且經(jīng)過5h體溫仍呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且與N1組和Q組比較各采樣時(shí)間點(diǎn)體溫變

15、化值均有顯著性差異(P＜0.01);與L組相比，發(fā)熱幅度升高，在4～5h期間，兩組△T差異顯著，表現(xiàn)為發(fā)熱時(shí)程延長(zhǎng)。當(dāng)預(yù)先在PO/AH區(qū)給予AMG9810后腹腔注射LPS，即在L+A組體溫也出現(xiàn)明顯升高，且經(jīng)過5h體溫仍呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，與N1組和A組比較各采樣時(shí)間點(diǎn)體溫變化值均有顯著性差異(P＜0.01);與L組相比，發(fā)熱幅度升高，在4～5h期間，兩組△T差異顯著，也表現(xiàn)為發(fā)熱時(shí)程延長(zhǎng)。
　　PGE2含量:在L組、L+Q組和L+A組

16、PO/AH區(qū)中的PGE2含量分別是391.199±13.264、509.161±9.944和497.961±17.876，與N1組的283.305±15.293比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;L+Q組和L+A組PGE2含量高于L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但L+Q組和L+A組之間比較無(wú)顯著差異;Q組和A組的PGE2含量分別是297.313±13.044和281.753±14.435，與N1組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)2:大鼠物理加溫處理

17、，檢測(cè)HSF1對(duì)P0/AH區(qū)TRPV1表達(dá)的影響
　　HSF1三聚體表達(dá)水平:H組明顯高于N2組，H+Q組略低于H組。Q組與N2組比較無(wú)顯著差異。
　　TRPV1表達(dá)水平:H組明顯高于N2組，而H+Q組略低于H組。Q組與N2組比較無(wú)顯著差異。
　　體溫:將大鼠置于人工氣候室（H組）可引起體溫升高，與N2組比較各采樣時(shí)間點(diǎn)體溫變化值均有顯著性差異(P＜0.01);當(dāng)預(yù)先在PO/AH區(qū)給予Que后再置于人工氣候室（H+Q組