藥理調節(jié)劑及細胞體積調節(jié)氯通道的作用特征及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一類陰離子通道,具有鈣離子和電壓依賴性。其組織分布廣泛,參與了眾多生理過程,包括調節(jié)上皮細胞的分泌,參與嗅覺、視覺的信號轉導,調節(jié)平滑肌、心肌、神經元的興奮性,還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系。其生理病理學意義十分重要,是重要的藥物的研究靶點。CaCCs的分子基礎一直備受爭議,直到近些年大家才逐漸公認兩大家族蛋白,八跨膜蛋白ANO1和四跨

2、膜蛋白Bestrophin1可能是CaCCs的分子基礎。當兩者表達于表達系統(tǒng)時都呈現(xiàn)CaCCs特性,如對鈣離子和電壓的敏感性。因為缺乏選擇性藥理學調節(jié)劑,對特定組織所觀察到的CaCCs究竟是由ANO1或是Bestrophin1構成難以判斷。
  氯通道調節(jié)劑眾多,但缺乏選擇性,且研究使用較為混亂。本研究第一部分就針對此現(xiàn)狀,在建立穩(wěn)定表達鈣激活氯通道ANO1及Bestrophin1的中國倉鼠卵母(CHO)細胞系的基礎上觀察比較7種

3、氯通道調節(jié)劑對ANO1及Bestrophin1通道的效能、效價及動力學特征,為進一步深入研究內源性CaCCs以及設計研發(fā)特異性通道調節(jié)劑提供強有力的支持。
  容積調節(jié)氯通道(volume regulated chloride channel,VRCC)是一類組織分布廣泛,對維持細胞容積穩(wěn)定具有重要生理學意義的陰離子通道。VRCC還與細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡等生理過程密切相關,并且已經發(fā)現(xiàn)在心律失常、心肌缺血再灌注損傷以及充血

4、性心力衰竭等病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。VRCC的分子基礎研究一直進展緩慢,研究者曾認為P-糖蛋白、核酸敏感性氯通道蛋白、電壓依賴性氯通道ClC-2和ClC-3以及鈣激活氯通道ANO1和Bestrophin等可能是參與構成VRCC的分子基礎。2014年,兩個研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)LRRC8蛋白家族參與構成了VRCC。本研究第二部分主要利用人胚腎上皮(HEK)以及中國倉鼠卵母(CHO)細胞觀察 VRCC的分子基礎及藥理學特征,重點集中在ANO1

5、和LRRC8A上。
  VRCC受細胞腫脹激活的機制尚不清楚,且其激活機制和調節(jié)因素在不同的細胞中有所不同。有研究報道稱細胞內鈣、酪氨酸介導的蛋白磷酸化、絲裂原激酶和酪氨酸激酶、小G蛋白RhoA以及活性氧(ROS)均可能都參與了VRCC的激活過程。本研究第三部分主要研究HEK293A細胞內源性VRCC的激活機制,重點研究細胞內鈣離子在VRCC激活中的作用。論文具體內容如下:
  第一部分:氯通道調節(jié)劑對鈣激活氯通道ANO1和

6、Bestrophin1作用的研究
  目的:
  研究比較幾種常見氯通道調節(jié)劑對鈣激活氯通道ANO1和Bestrophin1的作用。
  方法:
  1.建立穩(wěn)定表達ANO1和Bestrophin1的CHO細胞系;
  2.利用膜片鉗技術觀察比較不同氯通道調節(jié)劑對ANO1及Bestrophin1通道的藥理學作用及對通道動力學影響的特征。
  結果:
  1.western blot實驗結果顯示穩(wěn)

7、定轉染ANO1的CHO細胞系(CHO-ANO1)和穩(wěn)定轉染Bestrophin1的CHO細胞系(CHO-Best1)細胞膜上目的蛋白表達都明顯增加。膜片鉗實驗結果顯示,在CHO-ANO1以及CHO-Best1細胞系均能成功記錄到明顯的鈣離子依賴性的外向整流電流。
  2.膜片鉗研究結果發(fā)現(xiàn)7種常用氯通道阻斷劑中,對于+80 mV下的外向電流,DIDS對Bestrophin1(IC50 of3.93±0.73μM)的選擇性遠高于AN

8、O1(IC50 of548.86±25.57μM);而NFA對ANO1(IC50 of7.40±0.95μM)的選擇性遠高于Bestrophin1(IC50 of102.19±15.05μM)。CaCCinh-A01對ANO1和Bestrophin1通道的作用都比較強且效價相近,IC50分別是7.84±0.62μM和7.15±0.65μM。T16Ainh-A01可抑制部分ANO1電流,而對Bestrophin1電流幾乎無作用。鞣酸(ta

9、nnic acid)、NPPB和FFA對兩者的抑制作用接近。
  3.NFA、FFA以及NPPB對-80 mV下記錄的ANO1內向電流有雙向作用,低濃度(<100μM)可增大內向電流,而高濃度(>100μM)呈現(xiàn)抑制作用。NFA,F(xiàn)FA及NPPB可明顯改變ANO1的通道動力學特征,使其去活變慢。
  結論:
  1.成功建立了穩(wěn)定表達ANO1和Bestrophin1的CHO細胞系;
  2.七種常用氯通道阻斷劑中

10、,DIDS對Bestrophin1的選擇性遠高于ANO1;而NFA對ANO1的選擇性遠高于Bestrophin1。CaCCinh-A01對兩者的作用都比較強且效價相近。
  3.NFA,F(xiàn)FA及NPPB對ANO1內向電流具有雙向作用;且可明顯改變ANO1的通道動力學特征,使其去活變慢。
  第二部分:鈣激活氯通道ANO1參與構成容積調節(jié)氯通道分子基礎的研究
  目的:
  記錄穩(wěn)定轉染ANO1的HEK293或 C

11、HO細胞及基因敲除LRRC8A或ANO1的HEK293細胞中容積調節(jié)的氯電流并分析ANO1是否參與構成VRCC的分子基礎。
  方法:
  1.使用420 mOsm的CsCl電極內液與320 mOsm的NaCl細胞外液,利用全細胞膜片鉗技術記錄CHO或HEK細胞以及穩(wěn)定轉染ANO1的CHO或HEK細胞中VRCC電流;
  2.利用藥理學抑制劑觀察藥物對VRCC電流的作用;
  3.利用CRISPR/Cas9技術構

12、建LRRC8A基因以及ANO1基因敲除的HEK293A細胞系,觀察敲除細胞中VRCC電流;
  4.在LRRC8A敲除細胞中外源轉染ANO1后,觀察記錄VRCC。
  結果:
  1.當電極內液為420 mOsm CsCl,細胞外液為320 mOsm NaCl時,隨著細胞容積的增大,可記錄到明顯的VRCC電流。當HEK(CHO)細胞膜電位鉗制在-60 mV時,平均電流密度約為64 pA/pF(CHO約為48 pA/pF

13、)。給予-100 mV到+100 mV的ramp電壓鉗制程序時,VRCC呈現(xiàn)明顯的外向整流特性。而穩(wěn)定轉染 ANO1的細胞(HEK-mANO1)電流密度在-60 mV時約為113 pA/pF(CHO-mANO1約為63 pA/pF),明顯大于未轉染ANO1細胞的電流。另外,當使用躍階(step)去極化電壓刺激模式時,HEK或CHO細胞的VRCC電流呈現(xiàn)快速激活且快速去活的特征,當膜電位高于+60 mV時出現(xiàn)失活現(xiàn)象。而穩(wěn)定轉染 ANO1

14、的細胞的VRCC電流則呈現(xiàn)慢激活無失活的電流特征。
  2.第一部分研究發(fā)現(xiàn)NFA作為ANO1電流的強效抑制劑,100μM NFA可抑制約90%的ANO1電流。此部分實驗中發(fā)現(xiàn)100μM NFA對穩(wěn)定表達ANO1的細胞的VRCC電流呈現(xiàn)部分抑制作用,所抑制的電流表現(xiàn)為慢激活非失活的CaCC樣電流;10μM DCPIB是VRCC電流的相對特異性阻斷劑,對穩(wěn)定表達ANO1細胞的VRCC電流呈現(xiàn)部分抑制作用,所抑制的電流呈現(xiàn)快激活且失活

15、的LRCC8A樣電流。
  3.基因敲除HEK細胞內源性ANO1基因后,VRCC電流明顯減小。而敲除內源性LRRC8A基因后,VRCC電流基本消失。然而在敲除LRRC8A的細胞中外源轉染ANO1后,高滲內液和等滲條件下的GTPγs可部分恢復VRCC電流,呈現(xiàn)ANO1電流特征,表現(xiàn)為慢激活非失活,以及明顯外向整流特征。
  結論:
  1.穩(wěn)定轉染ANO1后的細胞VRCC電流明顯增加;敲除內源性ANO1基因后的細胞VRC

16、C電流明顯降低。
  2.敲除LRRC8A基因后,VRCC電流基本消失,再外源表達ANO1可部分恢復,說明ANO1可被細胞腫脹激活,可能是參與構成VRCC的分子基礎。
  第三部分:容積調節(jié)氯通道VRCC的激活機制
  目的:
  研究HEK293A細胞內源性VRCC的激活機制。
  方法:
  1.利用全細胞膜片鉗技術記錄HEK293A細胞中的VRCC電流;
  2.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀

17、察細胞內鈣信號的變化;
  3.利用PLC通路中相關分子的阻斷劑,以及經siRNA沉降PLC后,觀察對VRCC電流的影響;
  4.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞膜PIP2的水解情況。
  結果:
  1.使用高滲(420 mOsm CsCl)的電極內液,在HEK293A細胞記錄到的VRCC電流有震蕩的現(xiàn)象;VRCC電流的失活與電流幅度有關,表現(xiàn)為電流越小失活特征越明顯。使用等滲內液,低滲(220 mOsm)外

18、液記錄到的VRCC電流有與上述描述相似特征。
  2.低滲外液可誘導細胞內震蕩性鈣升高,且不被細胞外液中加入EGTA(2 mM,降低游離鈣)或CdCl2(100μM,阻斷鈣內流)所影響。
  3.高滲電極內液中加入20 mM EGTA可抑制VRCC電流的震蕩現(xiàn)象,但不影響最大電流幅度;而加入20 mM BAPTA,可明顯抑制VRCC電流;同樣使用thapasigagin預處理細胞使細胞內鈣耗竭后,VRCC電流基本消失。

19、>  4.3‰的血清可誘發(fā)一過性氯電流,此電流可被DCPIB或CaCCinh-A01基本完全抑制,同時血清還可引起一過性的細胞內鈣濃度升高。
  5.使用PLC阻斷劑 U73122(5μM)處理細胞,VRCC的電流會顯著減?。欢鳸73122的無效結構類似物U73343(5μM)對VRCC電流無明顯作用。
  6.HEK293A細胞轉染PIP2特異性熒光探針tubby-YFP,進行激光共聚焦實驗,結果顯示低滲細胞外液使熒光強度

20、明顯減弱。
  7.IP3阻斷劑Xe-C(1μM)可明顯抑制VRCC電流,PKC抑制劑Bis-1(200 nM)則對VRCC電流無明顯作用。高滲內液中加入GDP-βs(500μM)不會影響VRCC電流。
  8.使用siRNA干擾技術,使PLCβ4、PLCγ1以及PLCδ3表達降低之后,VRCC電流明顯減?。籔LCβ3和PLCε1表達降低對VRCC電流無明顯作用。
  結論:
  1.HEK293A細胞的容積調節(jié)

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