尤瑞克林對(duì)局灶性腦梗死大鼠Slit2-Robo1表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的：
　　我國(guó)缺血性腦血管病(Ischemic cerebrovascular disease, ICVD)的發(fā)病人數(shù)占全部腦血管疾病患者總數(shù)的60％~80%[1]，致殘率和復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。腦梗死發(fā)生后，盡快恢復(fù)血供是減少缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死后存在血管再生現(xiàn)象，新生的血管能有效阻止梗死體積的擴(kuò)大，挽救缺血半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞，減輕神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。腦梗死

2、后的血管新生涉及多個(gè)信號(hào)通路，同時(shí)又包含血管舒張、基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細(xì)胞活化、血管出芽和管腔形成等多個(gè)動(dòng)態(tài)連續(xù)步驟。Slit/Robo信號(hào)通路在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中能排斥性導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞的遷移，參與神經(jīng)元的芽生，促進(jìn)大腦環(huán)路的形成，并能通過(guò)減輕腦缺血后的炎性反應(yīng)起到神經(jīng)保護(hù)作用。在血管形成的過(guò)程中，Slit/Robo通路可能通過(guò)向?qū)а軆?nèi)皮頂端細(xì)胞的遷移，影響新生血管的分支和延伸。本課題利用大鼠大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）模型觀察Slit2及其受體R

3、obo1在梗死后腦組織中的表達(dá)變化及其與血管新生的關(guān)系，并觀察應(yīng)用尤瑞克林后，Slit2及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)變化，討論在腦梗死后的血管新生中Slit/Robo信號(hào)通路可能發(fā)揮的作用，從而為腦梗死的治療提供新的方法途徑。
　　材料和方法：
　　108只健康雄性 SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham group, SG）、模型組（Model group, MG）和尤瑞克林組（kallikrein, Urinary Kalli

4、dinogenase group, UKG），各組大鼠再隨機(jī)進(jìn)入梗死術(shù)后1d、3d、7d三個(gè)亞組，各亞組12只。采用線栓法建立永久性大腦中動(dòng)脈梗死（ permanent Middle Cerebral Artery Occlusion, pMCAO）模型。術(shù)后根據(jù)大鼠神經(jīng)行為表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分，納入成功模型并使用相同造模方法替代已剔除大鼠。UK組大鼠每日給予17.5×10-3 U·kg-1·d-1尤瑞克林尾靜脈注射，假手術(shù)組和模型組每日以相同

5、方式給予同等體積的0.9%生理鹽水。各亞組中6只大鼠用于新鮮取腦，另6只用于灌注取腦，并制作石蠟切片。采用Western blot方法檢測(cè)Slit2蛋白在各組大鼠中的表達(dá)；RT-PCR方法檢測(cè)Slit2 mRNA、Robo1 mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)方法觀察CD105標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，并在鏡下計(jì)數(shù)缺血腦組織中微血管密度（MVD）；利用免疫熒光雙重染色技術(shù)檢測(cè)CD105與Robo1是否有細(xì)胞表達(dá)共定位現(xiàn)象

6、。
　　結(jié)果：
　　1、梗死側(cè)腦組織Slit2蛋白和Slit2 mRNA的檢測(cè)結(jié)果
　　與假手術(shù)組相比，不同時(shí)間點(diǎn)模型組和UK組大鼠梗死側(cè)腦組織中Slit2蛋白和Slit2 mRNA明顯升高，1d、3d、7d呈逐漸升高趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。同時(shí)，UK組在缺血后1d、3d、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，缺血側(cè)腦組織Slit2蛋白和Slit2 mRNA的表達(dá)明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。

7、　　2、梗死側(cè)腦組織Robo1和VEGF mRNA的檢測(cè)結(jié)果
　　與假手術(shù)組相比，模型組和UK組大鼠梗死側(cè)腦組織中Robo1 mRNA在腦梗死后早期表達(dá)明顯降低，在梗死后3d表達(dá)開(kāi)始上升，7d仍未達(dá)到假手術(shù)組水平，與模型組相比，UK組大鼠Robo1 mRNA的表達(dá)在缺血后的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　與假手術(shù)組相比較，模型組和UK組大鼠梗死側(cè)腦組織中VEGF mRNA在各時(shí)間點(diǎn)明顯升高

8、，1d、3d、7d呈逐漸升高趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。同時(shí)，UK組在缺血后1d、3d、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，缺血側(cè)VEGF mRNA的表達(dá)明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　3、微血管密度的檢測(cè)結(jié)果
　　大鼠腦組織缺血區(qū)可見(jiàn)CD105免疫反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色塊狀或條索狀沉積，此為CD105陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組相比較，模型組和UK組大鼠腦組織缺血區(qū)中內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)的微血管密度在各時(shí)間點(diǎn)明顯升高，且呈逐

9、漸升高趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，UK組在缺血后1d、3d、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，缺血區(qū)域中內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)的微血管密度表達(dá)均高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果
　　大鼠腦組織切片在熒光激發(fā)后，Robo1發(fā)綠色亮光，主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞核聚集表達(dá)；CD105發(fā)紅色亮光，主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿聚集表達(dá)。Robo1和CD105有細(xì)胞共表達(dá)現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
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