多倍體魚(yú)轉(zhuǎn)座子的遺傳變異和雌核發(fā)育魚(yú)性腺發(fā)育的分子生物學(xué)研究.pdf

1、基因組內(nèi)獨(dú)立的DNA序列的轉(zhuǎn)座子（transposons），在物種進(jìn)化過(guò)程中有重要的作用。它能夠從一個(gè)位置轉(zhuǎn)出，然后插入到另一個(gè)位置。轉(zhuǎn)座子通過(guò)轉(zhuǎn)出和插入方式，改變生物基因組或基因結(jié)構(gòu)，為生物多態(tài)性和物種分化提供了重要來(lái)源。對(duì)轉(zhuǎn)座子的研究除能揭示其結(jié)構(gòu)和功能外，還在物種的起源和進(jìn)化、基因組的多態(tài)性，以及基因順次表達(dá)調(diào)控等方面具有重要意義。紅鯽（♀）（Carassius auratus red var）和團(tuán)頭魴（♂）（Megalobram

2、a amblycephala）亞科間的遠(yuǎn)緣雜交，成功的培育出了三倍體鯽魴和四倍體鯽魴。本文研究了四倍體鯽魴、三倍體鯽魴、紅鯽和團(tuán)頭魴基因組內(nèi)DNA轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)座子Tcl的分子結(jié)構(gòu)和遺傳特征；比較研究了不同倍性魚(yú)中高遷移率族蛋白編碼基因核苷酸和氨基酸序列的相似性，探討了該蛋白與DNA轉(zhuǎn)座子相互作用的關(guān)系；基于多倍化的異源四倍體鯽鯉、通過(guò)雌核發(fā)育技術(shù)、構(gòu)建的二倍體雜交克隆系平臺(tái)，利用抑制性消減雜交技術(shù)，研究了二倍體雜交魚(yú)形成二倍體卵子

3、的分子機(jī)制。本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下： 1、利用流式細(xì)胞儀技術(shù)，測(cè)定了團(tuán)頭魴單倍體基因組大小為1.55pg（1438 Mb），該基因組中檢測(cè)到一種新的DNA轉(zhuǎn)座子，命名為T(mén)mal，該轉(zhuǎn)座子屬于TCI家族的第3群。斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，其在團(tuán)頭魴基因組中具有670個(gè)考貝，并經(jīng)Southern blot雜交驗(yàn)證。Tmal推測(cè)的轉(zhuǎn)座酶氨基酸序，經(jīng)與分子重組恢復(fù)活性的鮭科魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)座子比對(duì)，發(fā)現(xiàn)具有一個(gè)類(lèi)似配對(duì)的鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)、一個(gè)類(lèi)GRR的AT錨定

4、基序，以及雙價(jià)核定位信號(hào)。由于Tmal序列已積累了多個(gè)內(nèi)部終止子，表明Tmal已在宿主內(nèi)失去轉(zhuǎn)座活性。這是首次報(bào)道了團(tuán)頭魴基因組中的DNA轉(zhuǎn)座子。 2、以團(tuán)頭魴為父本、紅鯽為母本的遠(yuǎn)源雜交，導(dǎo)致父本Tmal從雜交后代四倍體鯽魴基因組中完全切離，而在雜交后代三倍體鯽魴基因組中，Tmal序列僅發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換和插入突變，表明在遠(yuǎn)源雜交過(guò)程中，轉(zhuǎn)座子具有2種分子遺傳變異方式：（1）垂直失活，轉(zhuǎn)座子以點(diǎn)突變的方式積累突變；（2）隨機(jī)丟失，

5、轉(zhuǎn)座子以切除方式脫離于雜交后代基因組。 3、通過(guò)PCR方法，在4nRB基因組中檢測(cè)到一種新的轉(zhuǎn)座子，命名為T(mén)tel，屬于TC1家族的第1群。斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，在大小為1.76 pg的四倍體鯽魴基因組中，該轉(zhuǎn)座子具有880個(gè)拷貝數(shù)。本研究首次報(bào)道了脊椎動(dòng)物遠(yuǎn)源雜交導(dǎo)致了轉(zhuǎn)座子迸發(fā)。 4、利用RACE技術(shù)，獲得了三倍體鯽魴、四倍體鯽魴、紅鯽和團(tuán)頭魴的高遷移率族蛋白1基因mRNA全長(zhǎng)序列，其開(kāi)放閱讀框包含579nt，翻譯成19

6、3個(gè)氨基酸。序列比較分析表明：核苷酸水平上，四倍體鯽魴與母本紅鯽的同源性（99％）高于同父本團(tuán)頭魴的同源性（97％），三倍體鯽魴與父母本同源性（95％）低于親本之間的同源性（98％）；氨基酸水平上，四倍體鯽魴與父母本的同源性（100％）高于三倍體鯽魴與雙親的同源性（97％）。結(jié)果表明：遠(yuǎn)源物種間的雜交對(duì)兩性不育的三倍體鯽魴HMG1基因造成了一定的沖擊，分子遺傳效應(yīng)表現(xiàn)為三倍體鯽魴HMG1基因位點(diǎn)發(fā)生了變異；四倍體鯽魴HMG1氨基酸序列與

7、雙本的完全一致性，克服了等位基因的雜交不親和性，為兩性可育的異源四倍體鯽魴遺傳穩(wěn)定奠定了基礎(chǔ)。 5、采用抑制性消減雜交技術(shù)，異源四倍體鯽鯉雌核發(fā)育第3代（G3）卵巢生長(zhǎng)期cDNA為驅(qū)動(dòng)方，第4代（G4）卵巢增殖期cDNA為檢測(cè)方，構(gòu)建了一個(gè)正向消減cDNA文庫(kù)。通過(guò)斑點(diǎn)雜交篩選文庫(kù)，獲得了73個(gè)特異于G4表達(dá)的克隆，對(duì)其中部分克隆進(jìn)行了測(cè)序。BLASTX搜索結(jié)果表明，一些克隆cDNA推測(cè)的編碼蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已知序列具有

8、明顯的同源性。這些蛋白包括：信號(hào)識(shí)別顆粒9蛋白，ATP—連接盒轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，葡聚糖—葡萄糖融合蛋白，阻止有絲分裂細(xì)胞凋亡蛋白等。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT—PCR）證實(shí)上述編碼蛋白基因在卵巢增殖期上調(diào)表達(dá)。這些基因的鑒定，為研究鯽鯉雜交二倍體魚(yú)的卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 6、通過(guò)定量RT—PCR（Quantitative Real～time PCR），分析了編碼阻止有絲分裂細(xì)胞凋亡蛋白基因（PMC）的表達(dá)變化，在