香魚雌核發(fā)育誘導(dǎo)、性別標(biāo)記篩選及性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的研究.pdf

1、香魚（Plecoglossus altivelis）為一種集約化養(yǎng)殖的名貴魚類，養(yǎng)殖前景廣闊。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)香魚性成熟后雌雄個體之間存在性別生長相關(guān)二態(tài)性（sexual size dimorphism），雌魚銷售價格比雌雄混合銷售高出一倍以上。為提高香魚養(yǎng)殖效益，采用染色體操作技術(shù)研究香魚的雌核發(fā)育，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)篩選獲得一條雄性性別特異性標(biāo)記并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）研究分析了繁殖季節(jié)相關(guān)基因在性

2、腺中的表達(dá)，進(jìn)一步采用RT-PCR分析了性腺發(fā)育相關(guān)基因（foxl2、dax1、tra2和vasa）在成魚組織中的表達(dá)。結(jié)果如下：
　　香魚雌核發(fā)育誘導(dǎo)以靜水壓法最佳，15日齡子代存活率為(15.2±8.2)％。SSR標(biāo)記分析表明靜水壓法可以通過抑制第二極體排出誘導(dǎo)香魚雌核發(fā)育，雌核發(fā)育子代比例為87.5%。SRAP標(biāo)記K-group引物組合在母本中擴(kuò)增出母本特有條帶4條，父本特有條帶3條，子代樣本條帶分布狀況基本符合孟德爾定律；

3、P-group引物組合在母本中僅能擴(kuò)增出1條帶，無特異性，父本擴(kuò)增出特有條帶7條。No.7和No.14樣本檢測到父本特有條帶，屬于非雌核發(fā)育子代魚苗。與微衛(wèi)星標(biāo)記相比，SRAP標(biāo)記可通過一次反應(yīng)可同時實(shí)現(xiàn)對香魚基因組多個位點(diǎn)檢測，獲得更多的遺傳信息。
　　香魚性別相關(guān)標(biāo)記篩選結(jié)果表明：63對AFLP選擇引物擴(kuò)增出3733條清晰條帶，平均每組引物獲得清晰帶59條。其中E-ATG/M-CTG引物組合擴(kuò)增出一條大小為139bp的雄性特異

4、性條帶，轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記后命名為ayu102。12尾野生香魚檢測發(fā)現(xiàn)總計發(fā)現(xiàn)6條擴(kuò)增片段，其中5個片段（分別命名為：a、b、c、d和e）只在雄性個體中擴(kuò)增獲得；一條片段（命名為：f）在雌雄個體均出現(xiàn)，片段e和f序列同源性為96.67%。ayu102性別標(biāo)記有效性檢測采用45日齡養(yǎng)殖群體、野生群體和雌核發(fā)育群體。結(jié)果顯示片段e出現(xiàn)于所有的雄性個體中，養(yǎng)殖雌性群體出現(xiàn)片段e的頻率為6.7%。表明ayu102標(biāo)記可用于香魚性別鑒定研究，并對

5、揭示香魚性別決定系統(tǒng)具有重要的意義。
　　香魚繁殖季節(jié)性腺轉(zhuǎn)錄組測序總共獲得46829個unigene，精巢、卵巢分別獲得43125、46455個unigene。功能注釋獲得5348個GO items，1053個酶和279個KEGG途徑，共有2846個基因注釋到24個COG分類中。精巢、卵巢間存在大量差異表達(dá)基因。精巢高表達(dá)基因83個，除核糖體相關(guān)基因外，RPKM最高的前10個基因分別是微管蛋白、延伸因子-1、早期內(nèi)體抗原1、冷誘

6、導(dǎo)rRNA結(jié)合蛋白、肌酸激酶、肽酰脯氨酰異構(gòu)酶、熱激蛋白70kDa、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白、增殖細(xì)胞核抗原基因、熱激蛋白90。卵巢高表達(dá)基因42個，RPKM最高的前10個基因分別為N-myc原癌基因、NAD(P)H脫氫酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、微管蛋白、組蛋白H2A、延伸因子1、細(xì)胞周期蛋白A/B、熱激蛋白70kDa、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核糖體蛋白。精巢差異基因主要與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯、精子形成、脂肪酸代謝等相關(guān)；卵巢差異表達(dá)基因主要與信號

7、傳導(dǎo)、膜泡運(yùn)輸、類固醇激素代謝、脂肪酸代謝、介導(dǎo)免疫應(yīng)答等相關(guān)。
　　香魚dax1基因cDNA長度為1150 bp，編碼266個氨基酸，與斑馬魚（Danio rerio）的同源性最高為62%；tra2基因 cDNA長度為1821 bp，編碼320個氨基酸，與慈鯛（Pundamilia nyererei）的同源性最高為77.8%；foxl2基因cDNA長度為2290 bp，編碼305個氨基酸，與虹鱒（Oncorhynchus myk

8、iss）的同源性最高為94.7%；vasa基因cDNA長度為6099bp，編碼612個氨基酸，與大西洋鮭（Salmo salar）的同源性最高為74.3%。dax1基因表達(dá)模式存在性別相關(guān)二態(tài)性，在肌肉中表達(dá)水平最高。tra2基因在各組織中均能檢測到表達(dá)信號，雌雄組織表達(dá)量無顯著差異。foxl2基因的表達(dá)模式存在顯著性別相關(guān)二態(tài)性，主要在在雌性卵巢、心臟和肌肉組織中表達(dá)。vasa基因在精巢中表達(dá)量顯著高于卵巢，除肝臟組織外，其他組織均能