離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)洋蔥單倍體與分子標(biāo)記開(kāi)發(fā).pdf

1、洋蔥（Allium cepa L.，染色體數(shù)2n=2x=16）是百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）二年生蔬菜，在世界范圍內(nèi)栽培廣泛，其年生產(chǎn)量和生產(chǎn)面積居于世界蔬菜生產(chǎn)的第三位。我國(guó)種植洋蔥的歷史雖然較短，但是發(fā)展迅速，在全國(guó)各地廣泛栽培，是重要的出口創(chuàng)匯蔬菜。洋蔥是典型的異花授粉蔬菜，自交衰退嚴(yán)重。傳統(tǒng)育種方法育成優(yōu)良的自交系需要6～10年的時(shí)間，而通過(guò)單倍體途徑在較短時(shí)間內(nèi)就可以選育出整齊一致的純系，明顯提高選擇效率。

2、此外，單倍體加倍獲得的雙單倍體可作為重要性狀的遺傳分析、分子標(biāo)記及數(shù)量性狀研究的理想材料。本研究以不同來(lái)源的中日照型洋蔥自交系、常規(guī)種、雜交種為材料，通過(guò)離體雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)培養(yǎng)洋蔥花蕾，對(duì)適宜培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)程序優(yōu)化、植株再生、染色體倍性鑒定、染色體加倍技術(shù)、分子標(biāo)記鑒定等進(jìn)行了研究。利用獲得的洋蔥不育雙單倍體、可育雙單倍體以及二者雜交獲得的F1，采用SLAF-seq技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，獲得多態(tài)性SLAF標(biāo)記，并開(kāi)發(fā)出大量特異性SNP位點(diǎn)

3、。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以引自日本的3個(gè)中日照型洋蔥雜交種的花蕾為外植體材料，研究了2,4-D和6-BA濃度及配比對(duì)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，含有1.5 mg·L-12,4-D+1.5 mg·L-16-BA和2.0 mg·L-12,4-D+2.0 mg·L-16-BA的B5培養(yǎng)基適于胚的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率最高達(dá)到4.00％。⑵對(duì)洋蔥花蕾的誘導(dǎo)培養(yǎng)程序進(jìn)行了優(yōu)化研究，結(jié)果表明不同花蕾大小對(duì)洋蔥的離體雌核發(fā)育有很大影響。直徑2.

4、1～3.0 mm的花蕾離體誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)成胚率明顯低于其它直徑的花蕾。直徑3.1～4.0 mm的花蕾誘導(dǎo)成胚率最高?！厍颉幕ɡ俳?jīng)低溫預(yù)處理1d后成胚率明顯增高，預(yù)處理3d后胚的誘導(dǎo)率開(kāi)始明顯下降。而‘大寶’的花蕾經(jīng)低溫預(yù)處理1d后成胚率沒(méi)有顯著變化，預(yù)處理3d后胚的誘導(dǎo)率明顯下降。⑶不同基因型洋蔥雌核發(fā)育胚的誘導(dǎo)率存在很大差異。本試驗(yàn)供試的9個(gè)洋蔥基因型中胚的誘導(dǎo)率最高的是雜交種‘地球’，誘導(dǎo)率為4.67%，其次為‘大寶’和‘阿盾’，誘

5、導(dǎo)率分別為4.33%和4.00%，沒(méi)有顯著差異。2個(gè)常規(guī)種‘天正紅玉’和‘天正黃金’分別誘導(dǎo)出了6枚和8枚胚，誘導(dǎo)率顯著少于其他基因型。2個(gè)自交系503和217分別誘導(dǎo)出13枚和10枚胚，誘導(dǎo)率顯著大于常規(guī)種，但顯著少于5個(gè)雜交種?？偟膩?lái)說(shuō)，雜交種的胚誘導(dǎo)率大于自交系，自交系的誘導(dǎo)率大于常規(guī)種。⑷將所獲得的雌核發(fā)育胚轉(zhuǎn)移至含有30 g·L-1蔗糖的1/2B5+0.5mg·L-1NAA培養(yǎng)基中，5 d后即可發(fā)育成正常植株。利用流式細(xì)胞儀對(duì)

6、所獲得的再生植株進(jìn)行DNA相對(duì)含量測(cè)定，結(jié)果顯示正常二倍體的樣品分離峰出現(xiàn)在140相對(duì)熒光強(qiáng)度中，據(jù)此斷定分離峰出現(xiàn)在70熒光強(qiáng)度的為單倍體材料。為進(jìn)一步驗(yàn)證再生植株的倍性，對(duì)通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定過(guò)的植株再進(jìn)行根尖染色體計(jì)數(shù)分析，結(jié)果表明經(jīng)鑒定為二倍體的植株染色體數(shù)為2n=2x=16，鑒定為單倍體的染色體數(shù)為 n=x=8，與流式細(xì)胞儀的鑒定結(jié)果完全吻合。⑸研究了秋水仙素不同濃度、不同處理時(shí)間對(duì)單倍體植株染色體加倍效果的影響。結(jié)果表明，在處

7、理時(shí)間相同的情況下，隨著秋水仙素濃度升高，再生植株的存活率降低，但二倍體率增加；在相同秋水仙素濃度下，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，植株的成活率下降，但二倍體率增加。濃度為200 mg·L-1的秋水仙素處理48 h，對(duì)兩個(gè)供試品種的染色體加倍效果最好，成活率分別為61.11%、50.00%，加倍率分別為44.44%、38.89%。⑹利用DNF-566、RNS-357和AcSKP1標(biāo)記對(duì)部分再生植株進(jìn)行了檢測(cè)?！⒍堋?1株再生植株均為純合的msms

8、或MsMs，‘地球’的15株再生植株中在Ms位點(diǎn)的基因型均為純合的?！髮殹?6株再生植株中，有13株在Ms位點(diǎn)的基因型均為純合的，3株是雜合的。⑺生根良好的再生植株經(jīng)馴化、煉苗后，移栽到試驗(yàn)基地網(wǎng)棚，絕大多數(shù)再生植株成活，形態(tài)正常，生長(zhǎng)發(fā)育良好。洋蔥單倍體植株矮小、細(xì)弱，開(kāi)花期與二倍體洋蔥植株基本一致，但抽生花薹矮小。整個(gè)花序較小，花蕾數(shù)少而且小?；ㄋ幮?，沒(méi)有花粉。雙單倍體植株性狀表現(xiàn)符合二倍體特征，能正常開(kāi)花。經(jīng)分子標(biāo)記鑒定為Ms

9、Ms基因型的雙單倍體植株育性正常，而鑒定為msms基因型的雙單倍體植株表現(xiàn)為雄性不育。育性正常的雙單倍體植株開(kāi)花后套袋，放入蒼蠅授粉自交，獲得了發(fā)育飽滿、發(fā)芽力強(qiáng)的自交種子。對(duì)不育雙單倍體植株，利用其作為母本與可育雙單倍體雜交，獲得了F1代種子。⑻以獲得的可育雙單倍體DH-17、不育雙單倍體DH-1及部分F1代單株為材料，利用基于簡(jiǎn)化基因組深度測(cè)序的SLAF-seq技術(shù)，選擇洋蔥轉(zhuǎn)錄組作為參考進(jìn)行電子酶切預(yù)測(cè)，最終確定使用Pvu II+

10、Sca I酶切。將南芥的測(cè)序讀長(zhǎng)與參考基因組的比對(duì)結(jié)果顯示雙端比對(duì)效率為80.60%，大部分測(cè)序讀長(zhǎng)的插入片段長(zhǎng)度都在范圍之內(nèi)，表明建庫(kù)質(zhì)量良好。通過(guò)測(cè)序共獲得125.98 M讀長(zhǎng)，各樣品所獲讀長(zhǎng)數(shù)量在29736～30825419范圍內(nèi)。所有樣品的測(cè)序質(zhì)量值Q30均大于80%，說(shuō)明測(cè)序堿基錯(cuò)誤率較低，所獲數(shù)據(jù)合格。測(cè)序獲得平均GC含量為35.77%，而且含量比較平均，說(shuō)明達(dá)到了測(cè)序要求。對(duì)滿足質(zhì)量要求的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，共開(kāi)發(fā)出各類