前列腺癌細(xì)胞核內(nèi)AR結(jié)合核酸的篩選.pdf

1、前列腺癌惡化是在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生變化的。雄激素受體(AR)屬于轉(zhuǎn)錄核受體超家族的一員，主要通過靶基因的配體激活轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)前列腺癌的變化。因此，在研究激素變化和去勢抵抗性前列腺癌的時候，需要對AR調(diào)節(jié)的基因和AR基因組結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)節(jié)性的圖譜測序。
　　本課題采用雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP和本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI，分別對兩株細(xì)胞株進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，并對沉淀結(jié)果進(jìn)行高通量測序。對于高通量測序結(jié)果使用Ch

2、IP-qPCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP和雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI的AR ChIP-seq中富集區(qū)隨機(jī)各選取5個基因FOXP2，PCDH，LCP1，ZNF438，BDNR對它們進(jìn)行定量PCR，在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP和雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI中，這5個基因在AR ChIP中與IgG對照相比顯著富集，這證明ChIP-seq數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)聯(lián)合高通量測序法(ChIP-seq

3、)，在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP中發(fā)現(xiàn)9021個peaks，這些peaks在各基因組功能元件上的分布為:基因間區(qū)55.8％，基因內(nèi)含子區(qū)39％，基因上游20KB1.7％，基因下游20KB1.4％，基因外顯子區(qū)2.1％。雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI中發(fā)現(xiàn)4949個peaks，這些peaks在各基因組功能元件上的分布為:基因間區(qū)55.3％，基因內(nèi)含子區(qū)38.8％，基因上游20KB2.1％，基因下游20KB1.6％,基因外顯子區(qū)2.

4、2％。使用Model-based Analysis for ChIP-Seq(MAT)軟件分別在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP中找到了4143 AR binding sites并且在雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI中找到了2380 AR binding regions。將在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP中找到了4143 AR binding sites定位到基因組，共得到2796個基因。
　　將在雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-A

5、I中找到了2380 AR binding regions定位到基因組，共得到1854個基因。在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP中，一共有3871個AR的DNA結(jié)合區(qū)域可以匹配到距離TSSs50KB的范圍內(nèi)，約占93％(3871/4143)。354個結(jié)合位點(diǎn)距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的的20KB范圍內(nèi)，約占8.5％(354/4143)。在雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI中，一共有2185個AR的DNA結(jié)合區(qū)域可以匹配到距離TSSs50KB的范圍內(nèi)，

6、約占92％(2185/2380)。299個結(jié)合位點(diǎn)距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的的20KB范圍內(nèi)，約占12.6％(299/2380)。在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP中得到的2796個基因與在雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI中得到的1854個基因共有789個是相同的。對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)一個AR binding regions可以匹配到至少一個基因，同時一個基因至少有一個AR binding regions的富集，在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCa

7、P中平均一個基因可以有1.49個AR binding regions，在雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI中平均一個基因可以有1.28個AR binding regions。對這些基因的基因本體分析顯示，LNCaP和LNCaP-AI細(xì)胞中的GO terms有很大程度的重疊。然而，LNCaP-AI細(xì)胞卻含有一些LNCaP細(xì)胞所沒有的GO生物過程，包括:繁殖、復(fù)制、死亡、免疫過程、多細(xì)胞過程、色素沉著和病毒繁殖。兩者在GOterms中所含

8、有的不同基因主要有TNFAIP8，RTN4，APP，SYNE1。
　　為了進(jìn)一步研究AR在前列腺癌發(fā)生的過程中的影響作用，使用公開免費(fèi)的數(shù)據(jù)庫KEGG，調(diào)查了AR調(diào)控基因在生物通路水平上的富集情況?？梢钥闯鯝R調(diào)控的基因富集的KEGG通路大部分與各種疾病或者癌癥相關(guān)。
　　為了了解AR在雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP和雄激素非依賴性細(xì)胞株LNCaP-AI這兩種細(xì)胞株中的結(jié)合區(qū)域內(nèi)是否存在相似的motif，我們將兩株細(xì)胞株的測序

9、得到的所有peak按照富集度從小到大排列，使用meme軟件分別對兩株細(xì)胞株的top100的peak進(jìn)行預(yù)測，在兩種細(xì)胞株中分別得到了6個motif。根據(jù)這12個motif的親緣關(guān)系繪制了Newick-format tree。親緣關(guān)系相近的motif，被認(rèn)為有相近的功能。從親緣圖我們發(fā)現(xiàn)這12條motif在功能上差異不明顯。
　　本研究中利用染色體共沉淀聯(lián)合基因測序技術(shù)，從基因?qū)W角度發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子AR在全基因組的結(jié)合位點(diǎn)，并對測序結(jié)