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文檔簡(jiǎn)介
1、糖尿病腎病是糖尿病微血管病變之一,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,甚至危及患者的生命。探究糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制及如何延緩糖尿病腎病勢(shì)在必行。糖尿病腎病的病變特點(diǎn)包括腎小球肥大,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix ECM)增多及異常沉積,不斷進(jìn)展的腎小管間質(zhì)纖維化以及終末期腎小球硬化。其中,腎間質(zhì)纖維化是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),以大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)聚集為特征。研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growthf
2、actor beta-1 TGF-β1)是作用最強(qiáng)的致腎纖維化細(xì)胞因子,TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)TGF-β1的致纖維化作用[1]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor CTGF)是TGF-β1的下游因子,可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和ECM的分泌,在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用[2]。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7 BMP-7)是
3、TGF-β超家族的亞群之一,具有顯著的腎臟保護(hù)作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)BMP-7通過多種途徑發(fā)揮腎臟保護(hù)作用,并且能夠抑制TGF-β1/Samds信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,具有強(qiáng)大的抗纖維化作用,且這一作用是獨(dú)立于腎臟保護(hù)作用的[4]。氧化苦參堿(Oxymatrine OMT),分子式為C15 H24N2O,是從中藥苦參、苦豆子及廣豆根中提取的一種中藥單體,藥理作用廣泛,如抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及抗纖維化等作用。我們的前期研究證實(shí):糖尿病腎病模型大鼠腎
4、小球Smad1的表達(dá)增加,腎小球系膜內(nèi)基質(zhì)集聚,CTGF的含量增加。既往研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有改善腎臟纖維化的作用,但氧化苦參堿通過何種機(jī)制發(fā)揮抗纖維化作用仍不明確,由此我們提出假設(shè),氧化苦參堿是否通過影響細(xì)胞外基質(zhì)積聚來逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化呢?
本研究擬通過高糖誘導(dǎo)建立大鼠系膜細(xì)胞纖維化模型,應(yīng)用氧化苦參堿干預(yù)大鼠系膜細(xì)胞纖維化模型,測(cè)定模型中Ⅳ型膠原蛋白含量及BMP-7、TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3、Smad7
5、表達(dá)水平,在細(xì)胞水平探討B(tài)MP-7及TGF-β1/Smads信號(hào)通路與腎臟纖維化的關(guān)系,揭示氧化苦參堿改善糖尿病腎臟間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制,為臨床用藥提供理論依據(jù)。
目的:研究氧化苦參堿對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟纖維化的影響,探討氧化苦參堿改善腎臟纖維化的機(jī)制。
方法:15%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基(5.SmM+雙抗)培養(yǎng)大鼠腎臟系膜細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁生長(zhǎng)60%時(shí)隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組(NC)和高糖培養(yǎng)基組(HG),正常對(duì)照組
6、采用無血清低糖培養(yǎng)基(5.5mM)培養(yǎng),高糖培養(yǎng)基組則采用無血清高糖培養(yǎng)基(30mM)培養(yǎng)。建立高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞纖維化模型,將高糖培養(yǎng)基組隨機(jī)分為高糖組、氧化苦參堿低(O-L0.04 mg/ml)、中(O-M0.08 mg/ml)、高(O-H0.16 mg/ml)劑量組及坎地沙坦(Con0.005mg/ml)組,正常對(duì)照組仍給予無血清低糖培養(yǎng)基培養(yǎng),分別干預(yù)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后,觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;MTT比色法檢測(cè)各
7、組細(xì)胞存活率;用ELISA方法測(cè)定培養(yǎng)基上清液中Ⅳ型膠原蛋白的含量,確定造模成功。于氧化苦參堿及坎地沙坦干預(yù)48小時(shí)后,電鏡觀察藥物干預(yù)后系膜細(xì)胞形態(tài)變化;采用Real-Time PCR檢測(cè)大鼠腎臟系膜細(xì)胞BMP-7、CTGF、TGF-β1、 Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)水平;Western-blot檢測(cè)系膜細(xì)胞BMP-7、CTGF、TGF-β1、p-Smad3及Smad3的蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:
8、 1、高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)及相關(guān)指標(biāo)的變化
(1)細(xì)胞形態(tài):大鼠系膜細(xì)胞經(jīng)高糖分別干預(yù)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后,與Con組相比,HG組細(xì)胞形態(tài)改變,三組間形態(tài)無明顯差異。
(2)Ⅳ型膠原蛋白含量:HG組培養(yǎng)基上清液中ⅣV型膠原蛋白的含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05),提示高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞纖維化造模成功;分別用高糖培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中Ⅳ膠原蛋白的含量有上升趨
9、勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞纖維化可隨時(shí)間延長(zhǎng)有上升趨勢(shì),但程度有限。
(3)BMP-7、TGF-β1/Smads信號(hào)通路高糖干預(yù)48小時(shí)后,BMP-7、Smad2、Smad7的mRNA及蛋白表達(dá)水平與正常組相比明顯降低(P<0.05); TGF-β1、Smad3、CTGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05),表明高糖可以促進(jìn)系膜細(xì)胞纖維化的發(fā)生。與正常組相比,高糖組Smad2
10、/Smad3比值減小, p-Smad3/Smad3比值顯著升高,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
2、藥物干預(yù)48小時(shí)后,細(xì)胞形態(tài)、Ⅳ型膠原蛋白、BMP-7及TGF-β1/Smads信號(hào)通路各項(xiàng)指標(biāo)的變化
(1)細(xì)胞形態(tài):藥物干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù),但仍區(qū)別于正常對(duì)照組。
(2)Ⅳ型膠原蛋白含量:氧化苦參堿及坎地沙坦各干預(yù)組Ⅳ型膠原蛋白的含量均明顯低于高糖組(P<0.05),但仍高于正常對(duì)照組(P<0.0
11、5);Ⅳ型膠原蛋白的含量隨氧化苦參堿劑量增加而逐漸減少,提示氧化苦參堿具有改善腎臟纖維化的作用,其改善作用具有明顯的濃度依賴性??驳厣程菇档廷粜湍z原蛋白含量的作用優(yōu)于氧化苦參堿(P<0.05)。
(3)BMP-7、TGF-β1/Smads信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄水平
與高糖組相比,氧化苦參堿及坎地沙坦各干預(yù)組BMP-7、Smad2、Smad7 mRNA水平明顯增加(P<0.05),但仍低于正常對(duì)照組(P<0.05);TGF-
12、β1、Smad3、CTGF mRNA的水平明顯降低(P<0.05),高于正常對(duì)照組(P<0.05);氧化苦參堿各劑量組及坎地沙坦組Smad2/Smad3比值明顯高于高糖組(P<0.05)。
(4)BMP-7、TGF-β1、CTGF、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)水平
與高糖組相比,氧化苦參堿及坎地沙坦各干預(yù)組BMP-7蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),其中,氧化苦參堿高劑量組BMP-7蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比
13、不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),氧化苦參堿中、高劑量組仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)組CTGF、TGF-β1的蛋白表達(dá)水平低于高糖組(P<0.05),但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05);相比于高糖組,氧化苦參堿及坎地沙坦各干預(yù)組p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05),但高于正常對(duì)照組(P<0.05)。氧化苦參堿干預(yù)后系膜細(xì)胞纖維化程度改善。
結(jié)論:
1、氧化苦參堿可以改善高糖刺激的大
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