HMGB1-LPS介導的自噬-凋亡失衡在類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞致病理損傷中的作用和機制.pdf

1、目的:
　　初步探索高遷移率蛋白1(High Mobility Group Box Chromosomal Protein1，HMGB1)-脂多糖(LipopolysacLcharide，LPS)復合物誘導類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞(Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts，RASF)自噬(autophagy)水平上調(diào)在類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）發(fā)生發(fā)展

2、中所起到的作用，及其分子機制，為RA的臨床診治提供新的干預靶點。
　　方法:
　　我們采取體外體內(nèi)實驗相互驗證的方法，深入探討了HMGB1-LPS復合物在誘導RASF發(fā)生自噬過程中所起到的分子機制，本研究分為兩個部分:
　　第一部分 收集骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)和RA病人關(guān)節(jié)滑膜石蠟切片病理標本，分別用免疫組化方法檢測HMGB1、自噬相關(guān)蛋白5(Autophagy related geneprod

3、uct5，Atg5)、BECN編碼蛋白1(Beclin1)、微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3(microtubule-associated protein-light chain3，LC3)分子在RA和OA滑膜組織中的表達情況。應用Real-time PCR的方法檢測OA和RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)基因(Beclin1，Atg5，LC3)mRNA的相對表達水平。采用熒光Tunel法分別檢測骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞(Osteoarthritis Sy

4、novial Fibroblasts，OASF)和RASF的細胞凋亡情況。分析患者病理切片的染色陽性細胞比例和陽性的強弱，可得到兩組患者病損關(guān)節(jié)滑膜組織免疫組化的評分結(jié)果。分析RASF和OASF間HMGB1、自噬和凋亡相關(guān)分子的表達差異，以及這些分子表達情況與病人疾病活動度指標[C型反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、類風濕因子（Rheumatoid Factor，RF）、環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic c

5、irullinatedpeptide antibodies，CCP抗體)、紅細胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)]間的關(guān)系。
　　第二部分 將RASF傳代培養(yǎng)于六孔板中，待細胞融合度達80-90％之間即可開始實驗。按照空白對照組、HMGB1刺激組、LPS刺激組和HMGB1-LPS復合物刺激組依次向各處理組加入刺激劑，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后收集各處理組蛋白。蛋白質(zhì)印跡法(Western Bl

6、ot，WB)檢測LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表達變化和灰度比值的數(shù)量變化，同時檢測Beclin1的變化;細胞免疫熒光染色觀察各處理組Beclin1和Atg5的表達情況;透射電鏡觀察各刺激組RASF自噬情況;采用細胞凋亡檢測試劑盒(FITC-AnnexinⅤ/PI染色法）和流式細胞儀檢測各組RASF細胞的凋亡率;用WB檢測Bax、Bcl-2的表達。流式細胞術(shù)檢測經(jīng)HMGB1-LPS刺激的RASF細胞表面Toll樣受體-2(Toll-like re

7、ceptors2，TLR-2)、Toll樣受體-4（Toll-like receptors4，TLR-4）和糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)的表達變化。設計針對TLR-2、TLR-4和RAGE三個受體的siRNA，觀察siRNA抑制各受體后，HMGB1-LPS刺激RASF的自噬表現(xiàn)。PathScan Akt signaling antibody arra

8、y kit篩選可能激活的信號通路，再進一步采用WB驗證蛋白芯片初篩的結(jié)果。采用免疫化學發(fā)光法定量檢測培養(yǎng)上清液中的IL-1β、IL-2受體、IL-6、IL-8、IL-10以及TNF-α的水平。
　　結(jié)果:
　　1、納入研究的RA組和OA組病人臨床資料。
　　非選擇性地將20例RA病人和16例OA病人納入研究。RA組病人血清學疾病活動度相關(guān)指標ESR和CRP水平均顯著高于OA組病人，且納入的20例RA患者的血清CRP全部

9、高于8mg/L，其中18例(90％) ESR高于20 mm/h; CCP抗體的陽性率高達90％，濃度范圍為25-273.01 RU/ml; RF的陽性率為95％，濃度范圍為25-143.3 KIU/L，均顯著高于OA組病人。
　　2、RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白和HMGB1的表達水平顯著高于OA病人。
　　為明確RA和OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白和HMGB1的表達水平差異，采用Real-time PCR和/或免疫組化

10、的方法分別檢測了RA及OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織中Beclin1、Atg5、LC3及HMGB1的表達情況。與16例OA組病人滑膜組織相比，20例RA組病人滑膜組織中Beclin1、Atg5和LC3 mRNA的相對表達量和蛋白表達水平均顯著上調(diào)，同時HMGB1的表達水平亦顯著上調(diào)。RA組病人關(guān)節(jié)滑膜組織中Beclin1、LC3、Atg5和自噬相關(guān)蛋白的陽性染色免疫組化評分顯著高于OA組病人(P＜0.001)。
　　3、OA組病人關(guān)節(jié)滑膜組

11、織中成纖維細胞凋亡水平明顯高于RA組病人。
　　為明確RA和OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維細胞的凋亡水平差異，采用In SituCell Death Detection kit，POD分別檢測了RA及OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維細胞的凋亡情況。與16例OA組病人滑膜組織相比，20例RA組病人滑膜組織中成纖維細胞的凋亡水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。根據(jù)陽性染色細胞百分比對RA組和OA組個病人TUNEL(TdT-me

12、diated dUTP Nick-End Labeling)染色結(jié)果進行評分，OA組病人關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維細胞凋亡評分顯著高于RA組病人(P＜0.001)。
　　4、RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白和HMGB1表達水平與疾病活動度血液指標的相關(guān)性。
　　采用Pearson雙變量相關(guān)分析的方法，分析RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織LC3蛋白和HMGB的免疫組化評分與同一患者血清中反映疾病活動度指標水平的相關(guān)關(guān)系。RA患者病損關(guān)節(jié)滑膜組織

13、中LC3和HMGB1表達的免疫組化評分與同一患者ESR和CRP水平均呈強正相關(guān)關(guān)系（P均＜0.05）;與CCP抗體和RF水平亦均呈強正相關(guān)關(guān)系P＜0.001和P=0.002）。
　　5、RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織滑膜成纖維細胞凋亡水平與疾病活動度血液指標的相關(guān)性。
　　本研究中我們采用Pearson雙變量相關(guān)分析的方法，分析RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織滑膜成纖維細胞TUNEL凋亡實驗打分結(jié)果與同一患者血清中反映疾病活動度指標水平的相關(guān)關(guān)系

14、。RA患者病損關(guān)節(jié)滑膜組織中滑膜成纖維細胞TUNEL凋亡實驗打分結(jié)果與同一患者ESR和CRP水平呈強負相關(guān)關(guān)系（P均＜0.05）;與RA相關(guān)性自身抗體抗CCP和RF的血清水平亦呈強負相關(guān)關(guān)系（P均＜0.05）。
　　6、HMGB1-LPS可以誘導RASF的自噬激活和凋亡減弱，細胞的增殖速度加快。
　　WB檢測顯示，與空白對照組、HMGB1刺激組、LPS刺激組相比較，HMGB1-LPS復合物處理組RASF的自噬水平明顯增高;透

15、射電鏡觀察各刺激組自噬情況，能夠觀察到胞漿中大量的自噬小體和自噬溶酶體;間接免疫熒光染色在HMGB1-LPS復合物處理組RASF也觀察到Beclin1和Atg5表達增高的現(xiàn)象。采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，HMGB1-LPS復合物處理組RASF的凋亡率明顯降低。WB的檢測結(jié)果顯示，HMGB1-LPS復合物處理組RASF Bcl-2/GADPH的比值明顯升高，Bax/GADPH的比值顯著降低。采用細胞周期檢測試劑

16、盒經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，HMGB1-LPS復合物刺激組RASF細胞進入S/G2期明顯增多，細胞增殖速度加快。表明HMGB1-LPS復合物刺激組RASF的自噬激活，細胞凋亡水平明顯降低，細胞增殖速度加快。
　　結(jié)論:
　　在本研究中，我們證實了RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織高表達HMGB1和自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和Atg5，這些分子表達的增高與臨床血清疾病活動度指標的水平呈強正向關(guān)系;滑膜成纖維細胞凋亡顯著減少，滑膜成纖維細

17、胞凋亡數(shù)與臨床血清疾病活動度指標的水平呈負向關(guān)系。提示，RA患者病損滑膜組織存在自噬/凋亡的失衡，促進了疾病的進展;HMGB-1極有可能參與或介導了病損滑膜組織自噬/凋亡的失衡。在體外實驗我們證實，HMGB1-LPS復合物刺激體外培養(yǎng)的RASF，可以誘導RASF表面TLR-4表達水平顯著上調(diào)，通過TLR-4激活自噬相關(guān)信號通路Akt-mTOR使RASF自噬功能明顯增強，凋亡水平下降，細胞增殖明顯加快;同時亦激活炎癥相關(guān)性信號通路NF-κ