甲氨蝶呤聯(lián)合環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細(xì)胞P-糖蛋白介導(dǎo)的耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種以滑膜炎及血管翳形成為主要病理特征的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其致殘率高。以甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）為代表的改善病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs）藥物是RA治療的首選藥物，但臨床上存在多藥耐藥現(xiàn)象（multiple drug resistance, MDR

2、）。多藥耐藥基因1（MDR1）編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）可介導(dǎo)藥物排出增加，這被認(rèn)為可能是多藥耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制。最新研究發(fā)現(xiàn)，RA致病機(jī)制中的關(guān)鍵因子-白介素-6（Interleukin-6, IL-6）及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MDR產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。但是RA滑膜成纖維細(xì)胞（fibroblast-like synocytes, FLS）上， IL-6對P-gp的調(diào)控作用如何，MTX耐藥現(xiàn)象

3、與P-gp具體機(jī)制相關(guān)研究甚少。本文通過建立滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，研究IL-6對RA-FLS上P-gp的調(diào)控作用，比較分析MTX單藥及MTX聯(lián)合小劑量CTX兩種療法在誘導(dǎo)耐藥蛋白P-gp方面的差別及其具體機(jī)制。
　　目的：
　　通過檢測RA患者滑膜細(xì)胞上P-gp及JAK2-STAT3信號通路蛋白的水平，分析不同濃度IL-6、MTX單藥和MTX聯(lián)合小劑量CTX兩種治療方案誘導(dǎo)P-gp水平的差異及其可能參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，

4、明確 IL-6對FLS上P-gp的調(diào)控作用及信號通路，進(jìn)而探討MTX聯(lián)合CTX逆轉(zhuǎn)RA患者多藥耐藥性的具體機(jī)制。
　　方法：
　　通過細(xì)針滑膜穿刺活檢術(shù)提取3例RA初治患者滑膜組織，探索建立滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)至V代左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：第一部分，IL-6對RA-FLS P-gp表達(dá)的影響及機(jī)制研究：（1）不同濃度IL-6對RA-FLS P-gp表達(dá)水平的影響研究：將FLS分為A、B、C、D4組，分別加入不同處理：A組為

5、細(xì)胞對照組，B組加入低濃度的IL-6（4ng/ml），C組加入中濃度IL-6（20ng/ml），D組加入高濃度IL-6（100ng/ml），觀察不同濃度IL-6對P-gp表達(dá)水平的影響；（2）IL-6調(diào)控FLS P-gp過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究：將FLS分為A、B、C、D4組，分別加入不同處理：A組為細(xì)胞對照組，B組加入IL-6（100ng/ml），C組、D組分別加入JAK2-STAT3通路抑制劑AG490（50μmol/L）、ERK1/

6、2通路抑制劑PD98059（20μmol/L）預(yù)處理30分鐘后，再加入IL-6（100ng/ml），觀察參與IL-6調(diào)控P-gp過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；第二部分，MTX±CTX對RA-FLS P-gp的影響及其機(jī)制研究：將FLS分為A、B、C、D、E5組，分別加入不同處理：A組為細(xì)胞對照組，B、C組分別加入MTX（0.01μg/ml）、MTX（0.01μg/ml）+CTX（1μg/ml），D、E組加入AG490（50μmol/L）預(yù)處理30

7、分鐘后，再分別加入MTX、MTX+CTX，觀察MTX±CTX對P-gp表達(dá)的影響，研究參與MTX±CTX調(diào)控P-gp過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。將處理好的FLS放置于37℃ C02恒溫培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞，行流式細(xì)胞術(shù)檢測滑膜細(xì)胞膜蛋白P-gp表達(dá)水平， RT-PCR方法檢測滑膜細(xì)胞P-gp、JAK2、STAT3 mRNA的合成水平，Cell-based ELISA技術(shù)檢測滑膜細(xì)胞p-STAT3的蛋白水平，MTT實(shí)驗(yàn)觀察滑

8、膜細(xì)胞抑制率，分析IL-6、藥物、通路抑制劑對RA患者滑膜細(xì)胞P-gp的影響。
　　結(jié)果：
　　1、與對照組相比，各IL-6濃度組的P-gp表達(dá)增加，P-gp mRNA合成增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他各組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；比較各組細(xì)胞抑制率，IL-6高濃度組細(xì)胞抑制率高于IL-6低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　

9、2、與對照組相比，IL-6組P-gp表達(dá)增加，P-gp mRNA合成增多，JAK2、STAT3 mRNA合成水平、p-STAT3蛋白水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與IL-6組相比，AG490+IL-6組及PD98059+IL-6組P-gp的表達(dá)均有下降，P-gp mRNA合成均減少；AG490+IL-6組和PD98059+IL-6組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AG490+IL-6組P-gp下降趨勢更明顯（P＜0.05）；與IL

10、-6組相比，AG490+IL-6組的JAK2、STAT3 mRNA合成水平、p-STAT3蛋白水平均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；比較各組細(xì)胞抑制率，兩兩比較細(xì)胞抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；
　　3、與對照組相比，各藥物組P-gp表達(dá)增加，P-gp mRNA合成增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MTX組相比，MTX+CTX組P-gp表達(dá)較少，P-gp mRNA合成較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；

11、加入通路抑制劑進(jìn)行預(yù)處理后，P-gp表達(dá)較無通路抑制劑組降低，P-gp mRNA合成減少，JAK2、STAT3 mRNA合成水平、p-STAT3蛋白水平亦下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；比較各組細(xì)胞抑制率，兩兩比較細(xì)胞抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、IL-6上調(diào)RA-FLS P-gp表達(dá)，有一定濃度依賴性；
　　2、IL-6上調(diào)RA-FLS P-gp表達(dá)過程中有JAK2-STAT3和E

12、RK1/2通路的參與，以JAK2-STAT3通路為著；
　　3、MTX或MTX聯(lián)合CTX均可通過JAK2-STAT3通路上調(diào)RA-FLS P-gp表達(dá)；
　　4、MTX聯(lián)合CTX可削弱MTX單藥對JAK2-STAT3通路的激活作用，進(jìn)而一定程度上逆轉(zhuǎn)P-gp表達(dá)。
　　本課題為國家自然科學(xué)基金“甲氨蝶呤或來氟米特周期聯(lián)合環(huán)磷酰胺對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族介導(dǎo)的多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究（編號：8147618