三水白虎湯抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)研究.pdf

1、研究背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為中心病理的自身免疫病，其突出病理特點(diǎn)是滑膜增生并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞畸形。RA滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)大量增生并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤和新生血管形成是滑膜增生的基礎(chǔ)，而RA-FLS增生的機(jī)制主要有二類，一是受多種致炎因子所驅(qū)動的炎癥性增生（被動性增生），這其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)起到主要作用;二是由于RA-FLS本身的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)發(fā)生改變，生長周期調(diào)控機(jī)制障礙

2、，出現(xiàn)類似腫瘤樣轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征所致（主動性增生）。RA-FLS與正常人和其它關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞相比，其生物學(xué)特點(diǎn)產(chǎn)生了明顯的轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征。RA的治療目標(biāo)近年來已逐漸集中到真正阻斷滑膜增生和骨質(zhì)侵蝕方向，即所謂阻斷病情進(jìn)展。近年來針對致炎因子所致的被動性增生治療靶點(diǎn)的生物制劑研究取得了較多成果，當(dāng)前廣泛應(yīng)用的TNF-α拮抗劑能顯著控制RA的癥狀，并部分阻斷滑膜增生進(jìn)程;IL-1拮抗劑已經(jīng)在臨床上用于RA的治療，還在臨床試驗(yàn)階段的如IL-6

3、、IL-17拮抗劑也顯示出良好的治療效果。同時(shí)處于實(shí)驗(yàn)階段的轉(zhuǎn)基因治療方法即是以抑制或阻止RA-FLS主動性增生為目標(biāo)，也已顯示出良好的治療效果。如轉(zhuǎn)染fasl及fas相關(guān)性死亡決定蛋白(FADD)、NF-kb抑制蛋白（IkappaB）基因、陰性突變型原癌基因raf和myc等能誘發(fā)滑膜細(xì)胞大量凋亡，滑膜增生和軟骨侵蝕顯著受抑，甚至滑膜組織消失。
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹病”、“歷節(jié)”范疇?；顒悠谥嗅t(yī)病機(jī)主要是濕熱痹阻、痰凝

4、血瘀。根據(jù)上述病機(jī)以及我們多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，研制了三水白虎湯，由《千金》犀角散《廣濟(jì)》白虎方化裁而來，主要藥物有其藥物組成有:生地、水牛角、丹皮、寒水石、知母、青蒿泄熱透毒;虎杖、苡仁、白芥子、獨(dú)活、細(xì)辛除濕消腫;桑枝、雞血藤、蜈蚣、全蝎、地龍、南蛇藤、甘草通絡(luò)止痛。全方共奏清熱透毒、除濕消腫、通絡(luò)止痛之功效。該方目前在我科廣泛應(yīng)用于RA、OA、成人Still's病以及少年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（包括系統(tǒng)型及少關(guān)節(jié)類型）活動期的治療，并取得了不錯的

5、臨床治療效果。一直以來，我們對該方進(jìn)行了一系列的研究，從既往的藥理結(jié)果分析，該方的作用機(jī)制無疑是多途徑、多層次干預(yù)RA免疫炎癥的反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)。既能抗炎鎮(zhèn)痛、又能抑制免疫，同時(shí)還有一個(gè)重要的作用是抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖。三水白虎湯抑制RA-FLS增生的途徑可能既能抑制炎癥驅(qū)動的被動增生，又能抑制RASFs因轉(zhuǎn)化而出現(xiàn)的主動增生。根據(jù)我們前述的研究結(jié)果，三水白虎湯抑制被動增生的作用靶點(diǎn)可能主要是抑制了TNF-a的生成，并抑制了TNF-α

6、下游信號傳導(dǎo)分子NF-kβ和p38 MAPK信號通路。但復(fù)方中藥的藥理作用具有多靶點(diǎn)性，三水白虎湯抑制RA-FLS主動增生及被動性增生的其它靶點(diǎn)仍未明。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究試圖比較細(xì)胞在不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，對相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類和

7、鑒定。更重要的是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要分析蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究而發(fā)展起來的研究蛋白質(zhì)生物化學(xué)性質(zhì)的一系列新興技術(shù)，通過在蛋白水平上對機(jī)體在生理和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的不同以及對相關(guān)蛋白進(jìn)行分類鑒定，進(jìn)而從蛋白質(zhì)水平上闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的機(jī)制。通過將混合物中的蛋白質(zhì)分離出來，再對這些不同蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和比較，從而確定其濃度差異和（或）轉(zhuǎn)錄后修飾的差異。蛋白組學(xué)研究中的三大支

8、撐技術(shù)為雙向電泳、生物質(zhì)譜、計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為RA的研究提供了一個(gè)新的手段。近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)對RA患者血清、血漿、滑液、滑膜組織及滑膜細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的種類和含量的研究，獲得RA患者與健康對照人群間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并對某些蛋白進(jìn)行了功能分析，從而推測RA早期診斷的可能生物標(biāo)志。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)這一研究手段在國內(nèi)的復(fù)方中藥藥理研究中已有諸多報(bào)道

9、，利用該技術(shù)對中藥復(fù)方進(jìn)行多靶點(diǎn)的高通量篩選，可以將中藥復(fù)方的多組分、多靶點(diǎn)、多途徑特點(diǎn)與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)聯(lián)。另一方面通過蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差比性分析，還可以揭示中藥復(fù)方的作用靶點(diǎn)、作用環(huán)節(jié)和作用過程，發(fā)現(xiàn)復(fù)方中的有效成分及各成分間的協(xié)同關(guān)系，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)復(fù)方的優(yōu)化組合。一系列的研究成果對我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展對復(fù)方三水白虎湯治療RA的藥理研究具有重要借鑒意義。同時(shí)在試圖闡述中藥治療RA的改善病情作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究中，既往有不少工作觀察了中

10、藥及復(fù)方對體外滑膜細(xì)胞培養(yǎng)、多種細(xì)胞因子以及信號傳導(dǎo)通路的影響，但這些作用更多只是結(jié)果，并不是真正的藥物作用靶點(diǎn)。本項(xiàng)目首次以篩選三水白虎湯作用于RA滑膜細(xì)胞的靶點(diǎn)蛋白為目標(biāo)。同時(shí)鑒于復(fù)方中藥的藥理作用具有多靶點(diǎn)性，這也是復(fù)方中藥藥理研究的難點(diǎn)，為了縮小篩選范圍，本研究圍繞SSBH抑制RA-FLS增生這一重要藥理環(huán)節(jié)來尋找靶點(diǎn)，這樣既突出了SSBH的優(yōu)勢，又大大增加了技術(shù)上的可行性。
　　 本研究通過三水白虎湯含藥血清干預(yù)類風(fēng)濕

11、關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者的關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，觀察該方對細(xì)胞增殖抑制情況，同時(shí)通過檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中IL-6、IL-17水平及雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析含藥血清干預(yù)后FLS蛋白表達(dá)圖譜，并篩選出與正常對照的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，尋求該方抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步探討該方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。
　　 第一章三水白虎湯對關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響
　　 研究目的:觀察三水白虎湯(

12、SSBH)含藥血清對體外培養(yǎng)的滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)增殖的影響，探討SSBH治療RA的作用機(jī)制。
　　 材料和方法:滑膜組織來自南方醫(yī)院脊柱骨科收治行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)確診的RA、OA患者共6例（每組3例）。組織塊培養(yǎng)法收集RA、OA患者的關(guān)節(jié)FLS，體外培養(yǎng)傳代，并通過倒置顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法進(jìn)行鑒定。取3～6代細(xì)胞，MTT法連續(xù)檢測不同濃度(10％～30％)的含藥血清干預(yù)不同時(shí)間(24、48、72h)后對F

13、LS增殖的影響，并繪制細(xì)胞生長曲線。以來氟米特和生理鹽水含藥血清作對照。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用One Way ANOVA單因素方差分析，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni法。α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.FLS的原代培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法2～3d后見長梭型FLS從組織塊邊緣游走生長，并逐漸增多呈放射狀，一周后

14、細(xì)胞生長迅速，約2-3W長滿培養(yǎng)瓶底的70％-80％。
　　 2.FLS的鑒定在倒置顯微鏡下，所培養(yǎng)(RA、OA)細(xì)胞形態(tài)符合成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征，呈紡錘狀、星形或梭形，部分可呈大多角形。細(xì)胞核邊界清楚，呈卵圓形，位于細(xì)胞的中間，核仁清晰。Vimentin、CD68免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示Vimentin染色陽性，胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒，CD68染色陰性。流式細(xì)胞術(shù)檢測FLS CD55+細(xì)胞百分率為（98.4±2.29）％。

15、r>　　 3.MTT法檢測FLS的增殖率MTT結(jié)果顯示SSBH含藥血清可呈劑量和時(shí)間依賴性抑制RA、OA FLS的增殖。不同濃度(10％～30％)的SSBH干預(yù)FLS72h后，RA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為11.7％、42.9％、42.7％(p＜0.001);OA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為24.9％、47％、48％(p＜0.001);20％的含藥血清干預(yù)FLS不同時(shí)間(24、48、72h)后，RA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為11.

16、3％、28.4％、42.9％(p＜0.001); OA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為11.7％、33.9％、47％(p＜0.001)。不同濃度(10％～30％)的來氟米特(LEF)干預(yù)FLS72h后，RA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為9.9％、39％、38％(p＜0.001); OA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為26.8％、40％、40.8％(p＜0.001);20％的來氟米特(LEF)干預(yù)FLS不同時(shí)間(24、48、72h)后，RA-FLS

17、細(xì)胞增殖抑制率分別為15.5％、22.3％、39％(p＜0.001); OA-FLS細(xì)胞增殖抑制率分別為11.2％、26.1％、40％(p＜0.001)。無論是來源于RA還是OA，SSBH和LEF含藥血清作用于滑膜成纖維細(xì)胞48h后即表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖的顯著抑制作用，72h達(dá)到高峰。對兩種來源的FLS，LEF與SSBH含藥血清的抑制效率大致相當(dāng)。
　　 結(jié)論:中藥復(fù)方三水白虎湯能有效抑制關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖，這可能是該方治療

18、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。
　　 第二章三水白虎湯對關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維分泌IL-6、IL-17的影響
　　 研究目的:觀察三水白虎湯(SSBH)含藥血清對體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)炎(RA、OA)患者滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)分泌IL-6、IL-17的影響，探討該方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。
　　 材料和方法:組織塊培養(yǎng)法收集RA、OA患者的關(guān)節(jié)FLS，體外培養(yǎng)傳代，取3～6代細(xì)胞，加入20％含藥血清培養(yǎng)72h后收集各培養(yǎng)細(xì)

19、胞上清液，以來氟米特和生理鹽水含藥血清作對照。ELISA法檢測上清液中IL-6、IL-17的水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。最后于全自動酶標(biāo)儀讀取A450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線求得樣品IL-6、IL-17的水平。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，α=0.05。
　　 結(jié)果:SSBH和來氟米特(LEF)均可顯著抑制RA-FLS上清液中IL-17的含量，與生理鹽水(

20、NS)對照組比較有顯著性差異;但SSBH與LEF兩組比較沒有顯著差異。SSBH與LEF對RA-FLS上清液中的IL-6含量卻無顯著影響。SSBH含藥血清對OA-FLS的IL-6和IL-17分泌量均未見明顯影響。
　　 結(jié)論:中藥復(fù)方三水白虎湯能顯著抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-17，這可能是該方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥理機(jī)制之一。
　　 第三章三水白虎湯抑制關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 研

21、究目的:應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析三水白虎湯(SSBH)含藥血清對體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)炎(RA、OA)滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)蛋白表達(dá)差異并對差異蛋白加以鑒定，以期探尋SSBH抑制FLS增殖所表現(xiàn)出功能特性的分子基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討該方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。
　　 材料和方法:組織塊培養(yǎng)法收集RA、OA患者的關(guān)節(jié)FLS，體外培養(yǎng)傳代，取3～6代細(xì)胞，加入20％SSBH含藥血清培養(yǎng)，以加入生理鹽水制備的血清作對照，培養(yǎng)72h后，提取細(xì)胞總

22、蛋白，用雙向凝膠電泳(2-DE)分離細(xì)胞總蛋白，凝膠經(jīng)銀染顯色和圖像數(shù)據(jù)分析識別差異蛋白位點(diǎn);將這些差異點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)原位酶解及利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果:RA患者和對照組FLS的2-DE圖譜分別顯示出833、859個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。OA患者和對照組FLS的2-DE圖譜分別顯示出936、968個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。對二者相互匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行差異分析，以差異量大于3倍的表達(dá)量為準(zhǔn)，在RA-

23、FLS中初步篩選出16個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其中表達(dá)上調(diào)和高豐度表達(dá)的蛋白有7個(gè)，下調(diào)表達(dá)的9個(gè)。在OA-FLS中初步篩選出24個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其中表達(dá)上調(diào)和高豐度表達(dá)的蛋白有11個(gè)，下調(diào)表達(dá)的13個(gè)。將這些差異點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，成功鑒定出26個(gè)點(diǎn)，其中在RA-FLS中，SSBH下調(diào)Centrosomal（中心體蛋白）;GSS（谷胱甘肽合成酶蛋白）;Microtubule-associated serine/

24、threonine-protein（微管相關(guān)性絲氨酸/蘇氨酸蛋白）;Desmoplakin（橋粒斑蛋白）;Interleukin-3 receptor(IL-3受體蛋白);DST（肌動蛋白結(jié)合蛋白）;Exocyst（泡外蛋白）;Centrosome-associated(中心體關(guān)聯(lián)蛋白);上調(diào)Protein OS-9; Sorcin(抗藥蛋白);Interleukin-1 receptor antagonist(IL-1受體拮抗蛋白)等

25、蛋白的表達(dá)。在OA-FLS中，SSBH下調(diào)Sulfatase-modifying factor2（硫酸酯酶修飾因子2）;Coiled-coil domain-containing protein（卷曲螺旋包含域蛋白）;Desmoplakin（橋粒斑蛋白）;Centromere-associated(著絲粒相關(guān)蛋白);Sickle tail protein homolog(鐮刀尾蛋白同系物);acidic ribosomal（酸性核糖體蛋

26、白）;上調(diào)Myosin-Ⅰc（肌球蛋白-Ⅰc）;RABGAP1L(Rab蛋白GTP酶激活蛋白1);Centrosomal（中心體蛋白）;Rootletin（小根蛋白）;inosine triphosphatepyrophosphatase(肌苷焦磷酸酶); Myosin-Ⅲa(肌球蛋白Ⅲa);Translocon-associated protein subunit delta（易位子相關(guān)蛋白亞基）;dioxygenase（雙加氧酶）;